miR-939阻断剂通过调控CD2AP治疗肾病综合征的作用及机制

发布时间：2020-10-17 14:54

　　 目的:肾小球足细胞的损伤是蛋白尿产生的关键因素,是肾病综合征发病的主要机制,CD2相关蛋白(CD2-associated protein,CD2AP)是维持足细胞完整性和减少蛋白尿的最重要的狭缝隔膜蛋白之一。CD2AP缺陷或转录异常会导致足细胞衰竭和蛋白尿性肾小球疾病。肾病综合征患者体内存在许多不同小RNA(microRNA,miRNA),它们可能与肾病综合征的发生有关。肾脏中各种细胞的结构和功能,包括足细胞,受miRNA调节。一些miRNA的异常表达可导致足细胞融合和CDAP表达减少。本研究的主要目的是探索通过靶向CD2AP启动子区调节CD2AP启动子表达的特异性miR-939,从而为足细胞损伤的发病机制创造新的视野,并通过动物模型观察miR-939阻断剂对肾病综合征的治疗作用。方法:我们用RegRNA 2.0软件预测到在CD2AP的启动子区域中有2个miR-939的结合位点,然而在CD2APmRNA的3'非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)区域中没有miR-939的结合位点。我们用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)用于检测miR-939在HEK293细胞中的位置。通过PCR获得CD2AP基因启动子区的5'侧翼序列,并指向插入到pGL3-Basic,构建包含不同长度碱基序列的启动子荧光素酶报告基因质粒。载体构建成功后通过双荧光素报告基因检测系统鉴定启动子活性。利用点突变/缺失突变技,转染miR-939模拟物/miR-939抑制与启动子载体共同转染HEK293细胞中,鉴定miR-939是否可以通过靶向CD2AP启动子的结合位点来调节CD2AP的表达。转染miR-939后,通过染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecitation,ChIP)检测人CD2AP启动子区域中RNA聚合酶II的富集。肾病综合征病人外周血中检测miR-939和CD2AP的表达水平;建立阿霉素诱导的大鼠肾病模型,静脉注射miR-939阻断剂,通过肾脏外观,肾脏病理,血液生化及CD2AP的表达变化,观察miR-939阻断剂对肾病综合征的治疗作用。结果:通过生物信息学预测,在CD2AP的启动子区域中存在miR-939的两个特异性结合位点。FISH实验和细胞浆和细胞核分离后PCR证实miR-939可见于HEK293细胞的细胞核中。miR-939通过结合CD2AP启动子上-491~-468结合位点负向调控CD2AP启动子的活性;转染miR-939后ChIP实验发现RNA聚合酶Ⅱ在CD2AP启动子区的富集减少。在肾病综合征病人外周血中miR-939的表达增加而CD2AP的表达降低。miR-939阻断剂能改善肾病模型中肾脏的外观,血液生化指标,减轻肾组织的病变,增加CD2AP的表达量。结论:CD2AP是miR-939的靶基因,以转录前调控方式调控CD2AP的表达,在细胞核内miR-939通过减少RNA聚合酶Ⅱ在启动子区的富集而下调CD2AP的转录和表达,miR-939阻断剂对肾病综合征有一定的治疗作用。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R692
【部分图文】：

南京医科结 果患儿的外周血单个核细胞中，miR-939 NA 表达减少。的 SD，在足细胞完整性中起保护作用。竭和蛋白尿性肾小球疾病。我们先前细胞中 CD2AP mRNA 的表达。 据此我们相关，我们检测了原发性 NS 患儿外周血A 的水平，发现 miR-939mRNA 显着高于着下降。见图 1.

图 2. miR-939 对 HEK-293 细胞中 CD2AP mRNA 3’ 非翻译区无调控作用。图 2B.构建pmiR-RB-report TM-CD2APmRNA 3’ 非翻译区报告基因质粒，该报告质粒包含 SV40 启动子驱动的报告荧光，其下游构建了 CD2AP mRNA3’ 非翻译区区域，通过对该荧光的检测，即可验证 miR-939 是否对 CD2AP mRNA3’ 非翻译区有调控作用。图 2A.将 pmiR-RB-reportTM-CD2AP mRNA3’UTR 报告基因质粒与 miR-939 共同转染于 HEK-293 细胞中，进行萤

图 2. miR-939 对 HEK-293 细胞中 CD2AP mRNA 3’ 非翻译区无调控作用。图 2B.构建pmiR-RB-report TM-CD2APmRNA 3’ 非翻译区报告基因质粒，该报告质粒包含 SV40 启动子驱动的报告荧光，其下游构建了 CD2AP mRNA3’ 非翻译区区域，通过对该荧光的检测，即可验证 miR-939 是否对 CD2AP mRNA3’ 非翻译区有调控作用。图 2A.将 pmiR-RB-reportTM-CD2AP mRNA3’UTR 报告基因质粒与 miR-939 共同转染于 HEK-293 细胞中，进行萤
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本文编号：2844939