RAB14调控MARK通路在膀胱癌进展中的作用及机制研究

发布时间：2020-10-30 14:16

　　 目的:分析不同恶性程度膀胱癌组织中RAB14的表达水平,并探究其表达水平与膀胱癌临床分期、分化程度、有无远处转移等临床病理因素之间的相关性。采用基因芯片高通量筛选RAB14表达干扰后膀胱癌细胞的基因表达变化,预测RAB14下游的关键互作基因及分子机制。通过免疫组化和western blot等方法检测及验证RAB14表达下调后其下游关键基因及分子的蛋白翻译水平变化,探究RAB14在膀胱癌发生发展中的可能作用机制。方法:收集2013年1月至2018年12月于我院行全膀胱根治性术的膀胱癌组织标本80例及正常膀胱组织30例;采用免疫组化法检测RAB14在膀胱癌组织及正常膀胱组织中的表达,分析其表达水平与胱癌临床分期、分化程度、有无远处转移等临床病理因素之间的关系;体外培养不同的膀胱癌细胞株,采用qRT-PCR检测RAB14基因在各细胞中的表达水平,分析其表达差异。采用慢病毒技术构建RAB14表达干扰的细胞模型,采用高通量基因表达谱芯片技术筛选RAB14表达变化后膀胱癌细胞中基因表达的变化,预测RAB14的下游关键互作基因及分子机制。通过免疫组化法检测上述基因芯片高通量筛选的MAPK通路相关蛋白MAPK1的表达,分析其表达与RAB14的相关性;在构建RAB14干扰的细胞模型基础上,采用Western blot检测RAB14表达改变对MAPK通路相关蛋白MAPK1、MAPK8、DUSP6、FOS及SHC1的表达的影响。结果:1.膀胱癌组织中RAB14基因的表达水平要高于正常的膀胱黏膜,差异显著(P=0.0128),且侵袭性膀胱癌组织中RAB14的表达水平要明显高于非侵袭性膀胱癌组织,差异有统计学意义(P0.05);RAB14表达水平与膀胱癌的有无淋巴结转移(P=0.001)、临床TNM分期(P=0.009)、肿瘤细胞分化程度(P=0.000)呈正相关。qRT-PCR检测结果表明,与J82低转移潜能细胞相比,RAB14在高转移潜能的膀胱癌细胞株5637和T24中的表达明显增高,差异有统计学意义(P均0.05)。2.qRT-PCR检测KD组RAB14基因敲减效率相比NC组达到53.3%,RAB14敲减效果佳。PCA分析KD组和NC组之间差异较大,提示样本质量较好。基因芯片结果显示RAB14表达下调后,膀胱癌细胞5637中表达上调的基因共有498个,表达下调的基因有551个,GO富集分析差异表达基因的生物学途径(Biological process)主要富集在细胞凋亡的正负调控及细胞迁移上;细胞内组分(Cellular components)主要富集在胞外外泌体、细胞质基质及细胞质中;分子功能(Molecular function)主要体现在具有调节GTP酶活性、与蛋白质结合、与表皮生长因子受体结合及具有激酶活性等生物学功能。KEGG通路分析显示其差异表达基因主要富集在MAPK signaling pathway、Pathways in cancer、Pertussis、FoxO signaling pathway等信号通路上。3.免疫组化结果表明膀胱癌组织中MAPK1染色呈强阳性,其表达趋势与RAB14表达趋势正相关,即在癌组织中RAB14低表达时,MAPK1表达强度亦偏弱,在RAB14高表达的膀胱癌组织中MAPK1的表达强度则偏强;Western blot结果表明RAB14表达被干扰后,膀胱癌细胞中MAPK1和MAPK8的蛋白表达水平明显降低,而DUSP6,FOS及SHC1的蛋白表达水平则明显升高。结论:1.RAB14是一个与膀胱癌关系密切的基因,其在其癌组织及癌细胞中呈较高表达水平,且其表达水平与膀胱癌临床分期、肿瘤细胞分化程度及有无远处转移等临床病理因素呈正相关;2.基因芯片高通量数据显示,RAB14干扰表达后,影响多个基因的表达改变和多条信号通路传导被激活或被抑制,其中ERK/MAPK信号通路被显著抑制;3.RAB14通过上调MAPK1和MAPK8的表达并下调DUSP6、FOS和SHC1的表达,从而促进膀胱癌细胞的进展。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R737.14
【部分图文】：

第 2 章 免疫组化及 qPCR 技术检测膀胱癌组织及细胞中 RAB14 的表达StainingindexofRAB1401 02 03 0N o rm a l C a n c e r*P = 0 .0 1 2 8图 1-1. 分析不同的膀胱癌组织中及正常组织中 RAB14 蛋白的表达情况

图 1-3. 分析不同恶性程度的膀胱癌细胞中 RAB14 基因的表达差异ab 蛋白属于小 GTP 酶蛋白质超家族的一员，其分子质量约为 20~3功能是参与调控细胞膜运输的囊泡形成、囊泡形成转运及膜的融学过程[33]。研究发现 Rab 蛋白家族与肿瘤关系密切，其可调控肿质传递和信号转运，在肿瘤细胞的生长、侵袭、转移等生物学过键调控因子的角色[34]。Gong 等[35]学者研究发现，RAB18 在肝癌中异常高表达，癌组织中 RAB18 高表达的患者总体生存率低，R患者生存率相对较高，即 RAB18 越高，肝癌患者预后越差；体外过干扰肝癌细胞 RAB18 的表达后，肝癌细胞的克隆形成、增殖率迁移及侵袭能力明显减弱。提示 RAB18 基因表达与肝癌患者的预其表达水平高则患者预后不良，并可提高肝癌细胞的增殖率和促快了肝癌进展。Liu 等[36]学者报道，采用转染技术上调乳腺癌细胞A-MB-231 中 RAB9 表达后，细胞凋亡率明显下降，细胞的存活延

第 3 章 基因芯片技术分析 RAB14 干扰后下游基因表达谱的改变及对相关信号通路的影响2 结果2.1 膀胱癌细胞 5637 慢病毒转染效率及 qRT-PCR 验证通过采用慢病毒转染技术干扰 5637 细胞中 RAB14 的表达，荧光显微镜下发现NC组与KD组转染效果达90%以上，转染效果好（图2-1A）；进一步qRT-PCR验证 RAB14 干扰慢病毒转染效率，结果发现，与 NC 组相比，KD 组中 RAB14基因敲减效率达到 53.3%，说明 RAB14 敲减效果佳，符合预期（图 2-1B）。
【参考文献】

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本文编号：2862593