研究背景:RCC是泌尿系统的常见恶性肿瘤之一,严重威胁人类健康。最近的肾癌基因学研究结果揭示,肾癌本质上是一种与代谢相关的疾病[2]。有研究显示,伴有糖尿病的肾癌患者生存率低于无糖尿病的肾癌患者[3]。多年来国内外均见糖尿病患者患癌率明显高于非糖尿病患者的报道[4],并认为糖尿病是引发癌症发生和死亡的重要危险因素之一[5],从而引起了相关研究领域国内外学者的高度关注。Cheng S等人[13]的最新研究表明MF可明显提高局部肾癌患者的DFS和CSS。然而,另有研究显示[14,15]糖尿病是肾癌患者预后的不良因素,MF对T2D并发肾癌患者生存结果无明显改善作用。提示MF在细胞内外不同糖环境下具有不同的药理学效应。众所周知,MF是T2D一线降糖药物,同时也是AMPK的激活剂。AMPK是细胞能量感受器,当细胞缺乏能量时可促进AMPK激活。肿瘤细胞常处于营养缺乏状态,但在多种肿瘤细胞(含肾癌、乳腺癌、肺癌等)中却表现为AMPK抑制[20]。现有多项体外研究发现MF能够抑制前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肾癌细胞的增殖[8-13]。最近的体内外研究证实,MF能够通过激活AMPK、抑制m TOR通路,抑制肾细胞癌增殖、阻止RCC克隆体形成并诱导细胞周期阻滞[16]。本研究的前期体外细胞实验发现,细胞内低糖条件下MF可以促进RCC细胞增殖,并同时出现AMPK的激活。因此我们分析,MF治疗RCC预后不良的原因与细胞内营养缺乏状态下对AMPK的影响有关。近几年来PKM2在肿瘤发生发展过程中的分子调节机制方面取得了实质性的进展,有报道显示,PKM2核转位可激活转录因子,在β-catenin靶基因c-Myc的表达中起重要作用,并促进β-catenin介导的cyclin D1的转录,促进细胞生存和增殖[19]。进一步奠定了PKM2在调控肿瘤增殖环节中的重要位置。那么,低糖环境下MF引起的RCC细胞增殖是否与AMPK/PKM2信号通路有关?这引起了我们足够的关注,但目前国内外未见相关文献报道。目的:本研究将在低糖条件下探讨MF对RCC细胞增殖的影响,阐明MF在低糖条件下促进RCC细胞增殖的分子机制,为RCC临床治疗新策略的制定提供客观的实验室数据。方法:首先应用RCC细胞系A498和GRC-1细胞观察MF在正常或低糖条件下对RCC细胞增殖的影响:应用MTT法和Brdu掺入法检测细胞增殖;Western Blot法检测肿瘤细胞增殖标志物Ki-67的表达水平;行Western Blot检测AMPK及p AMPK表达水平;应用染色法观察MF对细胞凋亡的影响。随后进行MF在低糖条件下促进RCC细胞增殖的机制研究:si RNA技术敲除A498细胞AMPK表达或使用AMPK抑制剂后研究MF在低糖培养条件下对RCC细胞代谢、增殖情况、增殖标记物的表达情况、AMPK表达水平、β-catenin表达水平和PKM2表达水平的影响;si RNA敲除A498细胞β-catenin表达后研究MF在低糖培养条件下对RCC增殖情况、增殖标记物的表达情况和PKM2表达水平的影响;行免疫共沉淀方法观察低糖培养条件下,MF处理的RCC细胞AMPK、PKM2和β-catenin三者相互作用;应用si RNA技术敲除A498细胞PKM2的表达或应用PKM2抑制剂SKN后研究MF在低糖培养状态下对A498细胞增殖情况、增殖标记物的表达情况的影响。最后应用动物体内实验进一步研究MF和SKN的抗肿瘤作用:应用限制进食、饥饿的方法模拟低糖状态,将8周龄BALB/C分为4组:对照组、MF组、SKN组、MF+SKN组,将1×106A498细胞接种于裸鼠,分别在肿瘤接种后5天、10天、15天和20天记录肿瘤大小,同时观察一般状态,第20天小鼠处死后取瘤拍照,测量肿瘤大小;应用Western Blot方法和免疫组化方法观察肿瘤组织Ki67的表达水平。结果:1、正常糖浓度培养条件下,MF抑制A498和GRC-1两种RCC细胞的增殖;低糖培养条件下MF促进A498和GRC-1两种RCC细胞的增殖,并上调肿瘤增殖标志物Ki-67的表达,但对细胞凋亡无影响。2、正常糖浓度和低糖培养条件下,Western Blot结果显示MF均可促进AMPK磷酸化,且低糖条件与MF有协同增强AMPK磷酸化的作用。3、MF在正常糖浓度培养条件下降低RCC细胞的ATP和乳酸水平;在低糖培养条件下增加RCC细胞的ATP和乳酸水平(**,p0.01)。4、沉默AMPK后,低糖培养条件下MF诱导的RCC细胞ATP和乳酸水平增加的作用受到抑制(*,p0.05;**,p0.01)。Western Blot结果显示低糖培养条件下MF诱导的低糖培养条件下MF诱导肿瘤增殖标志物Ki-67表达上调的作用被抑制;MTT和Brdu结果显示:低糖培养条件下MF诱导RCC细胞增殖的作用被抑制;q PCR结果显示:低糖培养条件下MF诱导调节细胞增殖相关因子CCND1和c-Myc表达上调的作用被抑制(*,p0.05;**,p0.01)。5、低糖培养条件MF及AMPK联合作用RCC细胞48h,MTT和Brdu结果显示:AMPK抑制剂对低糖培养条件下MF诱导RCC细胞增殖的作用无影响(*,p0.05;**,p0.01),但MF诱导的RCC细胞ATP和乳酸水平增加的作用受到抑制(*,p0.05;**,p0.01)。6、低糖培养条件和MF作用下Western Blot检测细胞质及细胞核蛋白AMPK和β-catenin表达水平,细胞核内AMPK和β-catenin表达水平增加,二者具有协同作用。7、Western Blot结果显示:低糖培养条件下,敲除AMPK降低了MF诱导的RCC细胞AMPK和β-catenin核转位;MF与AMPK抑制剂联合应用,对MF诱导的低糖条件下胞核AMPK和β-catenin表达水平无影响。8、Western Blot结果显示,敲除β-catenin抑制了低糖条件下MF诱导的肿瘤增殖标记物Ki-67表达的上调;MTT和Brdu结果显示:敲除β-catenin抑制了低糖条件下MF诱导的细胞增殖;q PCR结果显示:敲除β-catenin抑制了MF诱导的调节细胞增殖相关因子CCND1和c-Myc的m RNA水平上调,二者具有协同作用。9、MF在低糖培养条件下Western Blot检测显示促进A498细胞PKM2核转位;敲除A498细胞中的AMPK表达后,细胞核内PKM2表达水平降低。10、低糖培养条件下,MF促进AMPK通过募集PKM2入核,促进β-catenin核转位并与β-catenin形成复合物;敲除AMPK或敲除PKM2均使MF促使的AMPK、PKM2和β-catenin的结合作用消失;敲除PKM2降低了MF作用下β-catenin的核转位,但不影响MF作用下AMPK的核转位。11、敲除A498细胞PKM2表达,Western Blot结果显示MF在低糖条件下诱导的肿瘤增殖标志物Ki-67的表达上调作用被抑制;MTT和Brdu结果显示MF在低糖条件下诱导的细胞增殖作用被抑制;q PCR结果显示低糖培养条件下MF诱导的调节细胞增殖相关因子CCND1和c-Myc的m RNA水平上调作用被抑制。12、PKM2抑制剂——紫草素(Shikonin,SKN)与MF低糖条件下共同作用,MTT和Brdu结果显示:在SKN作用下,低糖条件MF诱导A498细胞增殖的作用被抑制;q PCR结果显示:在SKN作用下,低糖条件MF诱导的调节细胞增殖相关因子CCND1和c-Myc表达上调的作用被抑制。13、限制进食、饥饿模拟低糖状态下对接种RCC细胞的裸鼠体内肿瘤生长有延缓效果,但无抑制效果。体内抑瘤实验结果显示:低糖条件下,MF不能抑制肿瘤生长,而能够提高肿瘤体积(1150mm3vs control 800mm3);SKN单独(600mm3)或与MF联合应用(350mm3)能够抑制肿瘤生长;抑制PKM2与MF联合应用抑制RCC增殖的效果优于单独抑制PKM2。Western Blot+免疫组化显示:MF单独应用促进肿瘤增殖,与SKN联合应用可抑制Ki-67的表达。结论:1.RCC细胞内低糖条件下MF通过促进AMPK募集PKM2入核促进β-catenin核转位并与β-catenin形成复合体,进而促进RCC细胞增殖;2.AMPK抑制剂的使用不影响上述过程,说明MF在低糖条件下诱导RCC细胞的增殖不依赖于AMPK激酶活性;3.敲除PKM2可以抑制体外低糖培养条件下MF诱导的RCC细胞增殖,抑制PKM2可在体内低糖状态下逆转MF诱导的肿瘤细胞增殖;4.裸鼠体内抑制PKM2与MF联合应用抑制RCC增殖的效果优于单独抑制PKM2。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R737.11
【部分图文】：
吉林大学博士学位论文培养板（2×104/孔），过夜贴壁后，加入 MF（3 mM）作用 24h 及 48 h，分别应用 MTT 法和 Brdu 掺入法检测细胞增殖。我们发现，在正常培养条件下，MF 抑制 A498 和 GRC-1 细胞的增殖，而低糖培养条件下，即使肿瘤细胞生长缓慢，也观察到了 MF 促进 RCC 增殖的作用（图 2.1 A-B）。另外，我们还将 A498 细胞接种与 6 孔细胞培养板（1×106/孔），过夜贴壁后，加入 MF（3 mM）作用 48 h，收集细胞，提取细胞总蛋白，行 Western Blot 检测增殖 Marker Ki67 表达水平，发现在低糖培养条件下，MF 上调 Ki67 的表达（图 2.1 C）。
第 2 章 MF 在低糖条件下对 RCC 细胞增殖影响的研究.4.2 MF 对 RCC 细胞凋亡无影响为了观察 MF 对 RCC 凋亡的影响，将 A498 细胞和 GRC-1 接种与 96 孔细养板（2×104/孔），过夜贴壁后，加入 MF（3 mM）作用 24h 及 48 h，应用法检测观察。我们发现，在正常培养条件及低糖培养条件下，MF 对 A498RC-1 细胞凋亡均无影响（图 2.2）。
图 2.3 MF 对 RCC AMPK 磷酸化的影响he effect of MF treatment on AMPK phosphoryexperiment was repeated for 3 times.metformin, MF）是分离自豆科植物 Galega offi件下的带正电荷的亲水性化合物，1957 年首和药物管理局于 1994 年批准 MF 用于 T2D 治用极少，如低血糖、高胰岛素血症、维生素见乳酸性酸中毒，这些风险因素与与超重的糖低[27-30]。在某些情况下，胰岛素似乎与促进生尿病的一线降糖药物[22,23]。T2D 的特征为肝
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本文编号：
2864034
