迁移侵袭抑制蛋白在肾癌中的表达及对肾癌细胞增殖、侵袭转移能力的影响研究

发布时间：2017-04-05 05:12

  本文关键词：迁移侵袭抑制蛋白在肾癌中的表达及对肾癌细胞增殖、侵袭转移能力的影响研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景:肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是肾实质细胞发生的恶性肿瘤病变,其病理类型多样,除80%-90%的透明细胞癌外还有腺癌、嫌色细胞癌等类型。近年调查显示,国内肾癌发病率约占全身恶性肿瘤2%-3%,在泌尿系统中的比率仅次于位居榜首的膀胱癌。相当数量以“血尿、疼痛、肿块”三联症就诊的患者已经处于中晚期。肾癌因病理类型的特殊性使其对放化疗敏感性差,目前临床常规以外科手术作为主要治疗方法,靶向药物辅助治疗,但对于术后肿瘤的复发、浸润、转移等进展事件无有效预防办法,对于部分丧失手术机会的T3期病变以及T4期病变尚无有效治疗手段。近年发现的迁移侵袭抑制蛋白(migration and invasion inhibitory protein,MIIP,亦称IIP45)具有抑制肿瘤细胞增殖、浸润转移的能力。当其位于染色体1p36.22的编码基因发生等位基因缺失或基因单倍剂量不足时,可诱发全身多系统恶性肿瘤,如前列腺癌、神经胶质瘤、结肠癌、乳腺癌、子宫内膜癌等。并且国外研究表明该基因是肿瘤细胞增殖、侵袭转移等生物学行为相关信号通路的上游调控基因,增加MIIP表达可有效抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭转移。但到目前为止尚无肾癌的相关报道。目的:1.明确肾细胞癌组织及癌旁正常肾组织中miip蛋白的表达水平,并分析其表达水平与肾细胞癌的发生及临床分期之间的关系。2.利用质粒转染技术制备过表达miip蛋白的肾癌786-0/miip细胞系,通过上调肾癌786-0细胞中miip表达量观察其对细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响。方法:1.不同病理组织中miip蛋白表达水平检测采用免疫组织化学染色(sp)法对84对肾细胞癌患者手术标本(配对肾癌组织组、癌旁正常肾组织组)进行染色,在显微镜下观察组织切片染色情况,运用半定量法分析肾细胞癌组织及癌旁正常肾组织中miip蛋白的表达情况,并通过统计学分析miip表达水平与肾癌的发生及临床分期的关系。同时提取患者肾癌组织及癌旁正常肾组织蛋白,通过western-blot检测肾细胞癌组织与癌旁正常肾组织中miip蛋白表达水平,并进行表达差异性分析。2.miip对肾癌细胞增殖、侵袭迁移能力的影响研究构建携带miip基因的p-flag-cmv4质粒,通过脂质体转染技术转染肾癌786-0细胞制备实验组786-0/miip细胞系,p-flag-cmv4空质粒转染786-0细胞制备对照组786-0/cmv4细胞系,未做转染处理的786-0细胞系作为空白组。western-blot、real-timepcr技术检测三组细胞miip蛋白和信使rna(messengerrna,mrna)的表达情况。通过细胞周期测定(流式细胞术)、mtt实验检测各组细胞的增殖能力,transwell实验、划痕实验检测各组细胞的侵袭迁移能力。结果:1.不同病理组织中miip蛋白表达水平检测运用sp法检测发现:肾细胞癌组织miip蛋白染色阳性比率为30.95%,癌旁正常肾组织miip蛋白染色阳性比率为85.71%(p0.05),其差异具有统计学意义。肾细胞癌不同临床分期中MIIP蛋白染色阳性比率分别为Ⅰ期54.55%,Ⅱ期40.54%和Ⅲ期13.89%;根据统计分析:Ⅰ期和Ⅱ期比较P0.25,无统计学意义;Ⅰ期与Ⅲ期比较,P0.00625,具有统计学意义;Ⅱ期与Ⅲ期比较,P0.0125,具有统计学意义。Western-blot检测结果分析:肾细胞癌组织中MIIP条带灰度值较癌旁正常肾组织的灰度值低,经t检验,P0.01。这与免疫组织SP法结果相符合。2.MIIP对肾癌细胞增殖、侵袭迁移能力的影响研究通过脂质体转染技术转染MIIP基因入786-0细胞后,利用Western-blot检测结果显示实验组786-0/MIIP细胞的MIIP蛋白表达量比对照组786-0/CMV4及空白组786-0增高。Real-time PCR检测结果显示:实验组MIIP mRNA相对表达量比对照组及空白组增高。流式细胞术检测细胞周期显示:实验组786-0/MIIP细胞系增殖指数PI:53.69,小于空白组786-0细胞系(PI:56.33)(P0.05),说明上调MIIP表达后细胞周期受到阻滞。MTT实验结果显示:上调MIIP表达后细胞增殖能力减弱(P0.01)。Transwell实验中实验组786-0/MIIP细胞穿透小室数为(15.23±3.21),少于对照组(39.03±7.49)及空白组(40.17±4.24)(P0.01),说明上调MIIP表达后786-0细胞侵袭能力减弱。细胞划痕实验结果显示上调MIIP表达后786-0细胞迁移能力弱于对照组及空白组(P0.01)。结论:MIIP蛋白在肾细胞癌组织及癌旁正常肾组织中均表达,前者比后者表达量降低。在肾细胞癌组织中MIIP的表达水平与肿瘤临床分期密切相关,Ⅲ期较Ⅰ期、Ⅱ期明显减少。通过质粒转染技术能够制备过表达MIIP的肾癌细胞系。转染成功的肾癌786-0/MIIP细胞系MIIP表达量增加,有效抑制了肾癌细胞的增殖、侵袭与迁移。
【关键词】：MIIP 肾细胞癌 免疫组织化学 增殖 侵袭 迁移
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.11
【目录】：

• 缩略语表4-7
• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-28
• 实验一 MIIP在肾细胞癌及癌旁正常肾组织中的表达28-38
• 1 材料与试剂28-30
• 2 实验方法30-31
• 3 结果31-35
• 4 讨论35-38
• 实验二 MIIP对肾癌细胞生物学行为影响的研究38-50
• 1 材料与试剂38-39
• 2 实验方法39-42
• 3 结果42-47
• 4 讨论47-50
• 小结50-51
• 参考文献51-62
• 个人简历和研究成果62-63
• 致谢63

  本文关键词：迁移侵袭抑制蛋白在肾癌中的表达及对肾癌细胞增殖、侵袭转移能力的影响研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：286524