白细胞介素6体外诱导肾小管上皮细胞表型转化

发布时间：2020-11-12 06:07

　　 背景移植排斥引起的慢性肾间质纤维化一直是移植肾慢性功能丧失的主要原因,其主要病理改变表现为肾小管萎缩伴随间质纤维组织增生,主要特点是肌成纤维细胞活化分泌细胞外基质。肾纤维化时有关肌成纤维细胞目前认为可能有多种来源,包括:肾内固有成纤维细胞的激活、骨髓内细胞的迁移来源、从肾小管上皮细胞、血管内皮细胞以及血管周细胞的转化而来。其中肾小管上皮细胞经上皮间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)一直是移植慢性纤维化不可忽视的来源之一。肾移植急性排斥反应组织学上虽形态多样,其主要特征是炎细胞(免疫细胞)的浸润,可表现为肾间质炎、小管炎和动脉内膜炎。相对于动脉内膜炎,以肾间质炎、小管炎为表现的急性肾排斥反应更为常见,特别是小管炎病变轻重可直接反映急性排斥的严重程度。近年来急性排斥反应浸润的巨噬细胞与移植肾慢性纤维化形成可能的相关性开始逐渐引起人们的关注。曾有报道急性排斥反应浸润巨噬细胞越严重,其肾移植后1年、2年和4年移植肾功能状态越差,提示巨噬细胞浸润可能与移植肾慢性纤维化形成密切相关。我们前期研究显示:激活的巨噬细胞与体外培养的大鼠肾小管上皮细胞NRK52E共培养后,可使培养的NRK52E出现明显的上皮标记物表达降低、同时出现间充质细胞标记物,即出现NRK52E的EMT;随之质谱分析显示激活的巨噬细胞后分泌多种细胞因子包括:TGF-β1(转化生长因子-β1)、IL-6(白细胞介素-6)、补体C3、Hsp90(热休克蛋白90)、MMP9(基质金属蛋白酶9)、Osteopontin(骨桥蛋白)和TNF-α(肿瘤坏死因子-α)。TGF-β1作为公认纤维因子,可诱导肾小管细胞发生EMT,进而可能参与纤维化的形成。除了TGF-β1外,激活巨噬细胞分泌的其他因子是否也具有诱导肾小管上皮细胞发生EMT,进而参与肾纤维化进程尚不十分明确。本研究我们选择细胞因子IL-6,观察单独的IL-6是否具有诱导体外培养NRK52E发生表型转化、进而发生EMT的能力。目的以大鼠肾小管上皮细胞株NRK52E为研究对象,检测IL-6诱导体外培养的NRK52E发生由上皮细胞表型向间充质细胞表型转化的能力。方法选择:E-钙粘蛋白(E-Cadherin,E-Ca)和细胞角蛋白-19(Cytokeratin,CK19)作为上皮细胞标记物,α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和波形蛋白(Vimentin)作为间充质细胞标记物。以终浓度分别为25ng/ml,50ng/ml和100ng/ml IL-6,在培养基DMEM中分别诱导培养NRK52E细胞24小时、48小时和72小时,同时以等体积IL-6溶解剂为对照组,先在倒置显微镜下观察不同诱导时间对照组和各诱导组NRK52E细胞的形态学变化,再以Real-Time qPCR方法分别检测各组细胞其上皮细胞标记物和间充质细胞标记物mRNA表达。同样以终浓度50ng/ml IL-6,诱导培养NRK52E细胞24小时、48小时和72小时,Western Blot方法检测上皮细胞标记物和间充质细胞标记物的蛋白表达。再以终浓度50ng/ml IL-6,诱导培养NRK52E细胞72小时,免疫细胞化学和免疫荧光染色进一步检测和验证上皮细胞标记物和间充质细胞标记物蛋白表达。结果形态学观察:体外培养的NRK52E对照组细胞在培养过程中始终保持贴壁生长,基本呈典型的鹅卵铺路石样,并且细胞间衔接紧密。而各诱导组细胞在诱导培养24小时后,均可见细胞出现有短梭形样,随着IL-6浓度的升高,细胞梭形越明显;继续诱导培养48和72小时后,各诱导组细胞见细胞长梭形愈加明显,提示IL-6可以使体外培养的NRK52E细胞发生形态学改变,从典型的上皮细胞的鹅卵石样形态变为短梭形和梭形,而且随着IL-6培养时间的延长、浓度的增加,细胞向梭形形态的改变越明显。Real-Time qPCR结果:在不同浓度的IL-6诱导培养NRK52E细胞24小时和48小时后,各诱导组细胞上皮标记物CK19、E-Ca的mRNA表达与对照组相比无明显差异,而间充质细胞标记物α-SMA、vimentin mRNA表达在诱导培养24小时后出现了短暂一过性的明显低于对照组细胞,继续培养48小时后,各诱导组α-SMA、vimentin mRNA表达则迅速恢复到与对照组表达水平基本相一致,甚至出现了在IL-6浓度为50ng/ml诱导组细胞培养48小时后,α-SMA mRNA表达明显高于对照组细胞。当继续诱导培养72小时后,上皮标记物CK19、E-Ca的mRNA表达均明显降低,同时间充质标记物α-SMA、vimentin的mRNA表达则明显升高且与对照组相比差异显著,说明IL-6诱导培养NRK52E细胞72小时后,细胞出现了明显的上皮细胞表型向间充质细胞表型的改变或称表型转化。Western Blot结果:浓度为50ng/ml的IL-6体外诱导NRK52E,诱导培养24小时和48小时后,其上皮细胞标记物CK19、E-Ca及间充质标记物vimentin的蛋白表达与相应的对照组相比未见有明显变化,但α-SMA的蛋白表达则表现为在培养24小时后出现了一过性明显低于相应对照组细胞,但当继续培养48小时后α-SMA的蛋白表达则迅速恢复,并表现为其表达明显高于对照组,差异有统计学意义。当继续培养72小时后,与对照组相比,诱导组细胞上皮CK19、E-Ca蛋白表达量均低于对照组,同时间充质标记物α-SMA、vimentin的蛋白表达则明显高于对照组,Western Blot蛋白表达结果与上述Real-time qPCR检查结果相一致。免疫细胞化学染色结果显示,NRK52E细胞在50ng/ml浓度的IL-6体外诱导72h后,对照组细胞见有上皮标记物E-Ca明确强阳性染色、呈线性分布于细胞膜,同时其间充质标记物vimentin则染色阴性。而诱导组细胞上皮标记物E-Ca的染色仅表现为弱阳性染色,同时间充质标记物vimentin出现了明确的阳性染色。免疫荧光染色结果与免疫细胞化学染色结果相一致,即IL-6诱导培养NRK52E72小时后,诱导组细胞上皮标记物E-Ca免疫荧光染色明显减弱,同时出现了明显的间充质标记物vimentin明确阳性染色。免疫细胞化学和免疫荧光染色进一步验证了IL-6诱导培养NRK52E细胞72小时后,细胞出现了明显的细胞表型转化。总之,从细胞形态、mRNA表达水平和蛋白表达水平均显示,IL-6可诱导体外培养的NRK52E细胞发生由上皮细胞表型向间充质细胞表型的改变或称表型转化。结论IL-6可以成功的诱导体外培养的肾小管上皮细胞株NRK52E细胞出现由上皮细胞表型向间充质细胞表型的改变或称表型转化。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R699.2
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 文献综述
        1.1.1 肾间质纤维化
        1.1.2 肾小管上皮细胞上皮-间充质转分化
        1.1.3 慢性移植肾纤维化与巨噬细胞
    1.2 引言
第2章 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 细胞株
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 其他试剂
    2.2 主要仪器
    2.3 实验方法
        2.3.1 肾小管上皮细胞（NRK52E）的培养、传代、冻存与复苏
        2.3.2 IL-6 体外诱导NRK52E细胞
        2.3.3 倒置显微镜观察诱导后的NRK52E细胞形态改变
        2.3.4 Real-Time qPCR检测诱导培养的NRK52E细胞表型转化
        2.3.5 Western Blot检测诱导培养的NRK52E细胞表型转化
        2.3.6 免疫细胞化学和免疫荧光检测诱导培养的NRK52E细胞表型转化
    2.4 统计学分析
第3章 实验结果
    3.1 IL-6 诱导NRK52E细胞后的细胞形态学改变
    3.2 Real-Time qPCR检测IL-6 诱导NRK52E细胞表型转化
    3.3 Western Blot检测IL-6 诱导NRK52E细胞表型转化
    3.4 免疫细胞化学染色检测IL-6 诱导NRK52E细胞表型转化
    3.5 免疫荧光染色检测IL-6 诱导NRK52E细胞表型转化
第4章 讨论
第5章 结论
参考文献
作者简介
致谢

【参考文献】

相关硕士学位论文 前2条

1 杜伟;活化的巨噬细胞诱导肾小管上皮细胞转分化[D];吉林大学;2015年

2 陈爽;TGF-β1诱导肾小管上皮细胞发生转分化状态研究[D];吉林大学;2008年

本文编号：2880359