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促红细胞生成素预处理骨髓间充质干细胞预防大鼠肾移植术后急性排斥反应的初步研究

发布时间:2020-11-22 04:51
   研究背景肾移植是治疗终末期肾病的最有效措施,但术后排斥反应制约了其疗效。随着新型免疫抑制药物的临床应用和并发感染的预防,提高了肾移植病人的短期生存率,然而长期服用免疫抑制剂,导致感染及恶性肿瘤的发生率明显增加,影响了患者的长期存活。因此,寻找一种使机体产生免疫耐受的方法替代免疫抑制剂,既可以降低排斥反应的发生率,同时避免长期服用免疫抑制剂带来的不良反应,可能是改善肾移植的一种很有前途的方法。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一类具有自我复制和多向分化潜能的多能干细胞,在不同的诱导条件下,它们可以分化为多种组织,包括脂肪、骨、软骨、肝和肾等。此外,骨髓间充质干细胞具有低免疫原性和免疫抑制作用,并能优先归巢于损伤组织,促进组织修复,但其改善能力有限,移植细胞向损伤肾脏的归巢数量有限是影响修复效率的原因之一。促红细胞生成素(EPO)是一种能调节红系祖细胞生长分化的糖蛋白,其对于治疗肾损伤的有效性已被广泛证明。目前鲜有相关研究表明EPO是否会对BMSCs移植的定向肾脏归巢及旁分泌有益,从而增强移植治疗效果,降低肾移植术后排斥反应的发生。本实验对EPO预处理BMSCs后能否降低大鼠肾移植术后排斥反应的发生率进行初步研究。目的构建同种异体大鼠肾移植模型,经尾静脉注射促红细胞生成素(EPO)预处理的骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察BMSCs对预防大鼠肾移植术后排斥反应的作用。方法1、肾移植模型的建立与分组选取SDF级体重(200~250)g的雄性SD、Wistar大鼠各24只,检疫室预养3d,模型建立后随机分为4组,每组6只,2%戊巴比妥钠溶液(30mg/kg)腹腔注射麻醉,供肾用1%肝素水灌注苍白后,低温冰桶保存。分别麻醉供、受鼠后行原位肾移植手术,术后开放血流,若肾脏充盈良好,血供丰富,且5分钟内不变黑,则关闭腹腔,成功建立大鼠肾移植模型。对照组(肾移植未干预组):大鼠肾移植模型建立后,未进行任何干预;EPO干预组:肾移植建模后立即予1ml含有500IU的EPO尾静脉注射;BMSCs移植组:肾移植建模后尾静脉注射1ml含有1×106个BMSCs的PBS液;EPO-BMSCs组:肾移植建模后尾静脉注射1ml经EPO体外预处理的含有1×106个BMSCs的PBS液。各组大鼠均在温度、湿度适宜的环境下饲养,自由饮食、饮水。分别于建模后1d、5d处死部分大鼠(每次每组处死3只),下腔静脉取血,分离血清后-20℃冰箱保存备用,检测血肌酐。肾移植术后1d、5d分别取受者双侧肾脏,新鲜标本-80℃冻存,留做Western-blot检测,10%甲醛固定标本备作病理。2、血肌酐水平检测肾移植术后,第1天和第5天,从肾移植大鼠取血标本,分离血清,并用试剂盒检测血清肌酐。3、组织病理学观察组织标本10%甲醛固定、石蜡包埋后,取5μm切片脱蜡至水,按常规方法分别行HE染色切片,每例切片在高倍镜下(200×)随机观察10个互不重叠肾单位视野并拍照,分析炎症及排斥反应发生的可能性。4、Western Blot取肾组织80-100 mg加入1ml三去污裂解液,4℃20 000r/min离心10 min,取上清再次4℃12 000 r/min离心10 min,BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度,取30μg蛋白进行SDS-PAGE电泳。蛋白转移至PVDF膜上,将PVDF膜放入4mL含5%的BSA/TBST室温70rmp摇动封闭1h,加入4mL抗体/BSA稀释液室温孵育半小时后,4℃冰箱孵育摇床过夜,TBST洗膜,70rmp3次×10 min,加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(1:2000)二抗,室温摇动1h,洗膜3次×10min,置于伯乐化学发光成像系统中成像,CCD自动获取图片结果。采用ImageJ图像分析软件对获得每个特异性条带积分灰度进行半定量分析。测量条带的灰度值,β-actin为内参,各蛋白的表达强度为两者灰度的比值。5、统计学分析方法计量资料采用均值±标准差来表示,t检验用于分析两组间的差异,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),需进行Student-Newman-Keuls方差齐性检验,用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析,P0.05表示差异具有统计学意义。结果1、血肌酐水平大鼠肾移植术后第1天,与EPO-BMSCs组血肌酐水平相比,对照组、EPO组及BMSCs组血肌酐水平较高,但差异无统计学意义(P0.05);术后第5d,与EPO-BMSCs组血肌酐比较,对照组、EPO组及BMSCs组血肌酐水平较高,且差异有统计学意义(P0.05)。2、组织病理学检查结果:移植后第1天,每组均发生炎症反应,对照组3例中2例发生排斥反应,其余各组未发生排斥反应,但每个移植肾都是肿胀的。术后第5天,对照组3例和EPO组3例均发生排斥反应。BMSCs组3例中有1例发生排斥反应,EPO-BMSCs组无急性排斥反应。移植肾形态肿胀,急性排斥反应发生时,移植肾呈暗红色。3、Western Blot 结果Western Blot检测表明,大鼠肾移植术后第一天,与EPO-BMSCs组相比,对照组、EPO组和BMSCs组的IFN-γ灰度值比值更高,但EPO-BMSCs组与BMSCs组相比,差异无统计学意义(P0.05);术后第5天,与EPO-BMSCs组相比,对照组、EPO组和BMSCs组IFN-γ灰度值明显升高,且差异有统计学意义(P0.05)。大鼠肾移植后第1天,与EPO-BMSCs组比较,对照组、EPO组和BMSCs组IL-4灰度值比值更高,但差异无统计学意义(P0.05);肾移植术后第5天,与EPO-BMSCs组相比,对照组、EPO组和BMSCs组IL-4灰度值比值不同,但差异无统计学意义(P0.05)。肾移植术后第1天,与EPO-BMSCs组比较,对照组、EPO组和骨髓间充质干细胞组(IFN-γ/IL-4)灰度值比值更高,但差异无统计学意义(P0.05);术后第5天,与EPO-BMSCs组比较,对照组、EPO组和BMSCs组的(IFN-γ/IL-4)灰度值比值明显增高,且差异有统计学意义(P0.05)。结论EPO预处理BMSCs可降低急性排斥反应的发生率,可能是通过增加注射的间充质干细胞到达移植肾脏的数量,及调节相关免疫因子的表达,如调节IL-4、IFN-γ、IFN-γ/IL-4等的表达来调节Th1/Th2平衡,改善肾移植微环境,来预防排斥反应的发生。
【学位单位】:南方医科大学
【学位级别】:硕士
【学位年份】:2018
【中图分类】:R699.2
【部分图文】:

迁移距离,浓度,存活率


?B??Fig.?1-1?Survival?rate?of?BMSCs?in?difFerentl?EPO?concentrations?at?24h?(A)?and?at?48h?(B)??图1-1在不同EPO浓度下,BMSCs的存活率在24小时(A)和48小时(B)??表1-1A在不同EP0浓度下,24小时BMSCs的存活率??组别(EP0浓度)?例数?存活率??0?3?1??10?3?0.9889±0.0071??100?3?0.9804±0.0524??500?3?0.?9502?±0.?0564??1000?3?0.8405?±0.0235??各组相比,P>0.?05,差异无统计学意义。??16??

划痕实验,图像,浓度


?p-3Ctin??Fig.?1-4?The?protein?expression?of?CXCR4?in?the?concentration?of?500IU/ml?of?EPO??图1-4在500IU/ml的促红素浓度下,CXCR4蛋白的表达量??18??

浓度,促红细胞生成素,划痕实验,骨髓间充质干细胞


?1000??Fig.?1-3?Images?of?Scratch?test?under?the?microscope?(x?l〇〇)??图1-3在显微镜下(xl〇〇)划痕实验图像??4.3不同浓度促红细胞生成素与BMSCs共培养时,CXCR4的蛋白表达量??Westem-blot分析表明,骨髓间充质干细胞中CXCR4的蛋白表达在??EPO-BMSCs?组的灰度值比值(0.2501±0.001)与?BMSCs?组(0.2128±0.0035)??相比大幅增加,且差异有统计学意义(PC0.05)。??g〇.3-,?*?EPO-BMSCs?BMSCs??1?n,?.?—■■■?group?group??>?0.2-??2?卜:二?SWftW???I-?m?cxcR4?—?一—??10?J?mm??_?EPOBMSCs?E23?BMSCs?p-3Ctin??Fig.?1-4?The?protein?expression?of?CXCR4?in?the?concentration?of?500IU/ml?of?EPO??图1-4在500IU/ml的促红素浓度下,CXCR4蛋白的表达量??18??
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 汤勇;王帅;周训平;陈宪林;王晓芹;;间充质干细胞免疫活性调节作用研究进展[J];重庆医学;2010年04期

2 杨光忠;陈文明;;间充质干细胞的免疫调节功能[J];中国全科医学;2009年16期



本文编号:2894148

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