GSDME诱导的细胞焦亡在糖尿病肾病中的作用研究

发布时间：2020-11-22 08:09

　　 目的 糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是继发于糖尿病的一种微血管并发症,它占全球范围内终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的40%以上,是糖尿病患者死亡的重要原因。有研究表明,细胞焦亡参与了糖尿病及其并发症糖尿病心肌病的发病过程中。而在感染性炎症和胃癌中发生的细胞焦亡是由Gasdermin家族蛋白介导的一种炎症性程序性细胞死亡形式。Gasdermin E(GSDME)在肾脏组织中高表达,细胞焦亡是否参与了糖尿病肾病的发病过程,Gasdermin E是否影响糖尿病肾病中肾脏细胞焦亡尚未见报道,本研究旨在明确GSDME、GSDME-N、caspase-3、p17、caspase-1、p20、IL-1β以及m IL-1β在糖尿病肾病中的表达情况和相互作用,探究caspase-3裂解的GSDME诱导的细胞焦亡在糖尿病肾病发病过程中的作用,以期为DN的诊疗、病情监测提供新的靶标。方法 1.一次性腹腔大剂量注射链脲佐菌素(1%STZ,65 mg/kg)构建SD大鼠1型糖尿病肾病动物模型,检测对照组(Ctrl组)大鼠和糖尿病肾病组(DN组)大鼠的血糖、体重、24 h尿量、尿糖和24 h尿蛋白;2.光学显微镜下观察苏木精-伊红(HE)和糖原(PAS)染色后肾脏组织结构的病理变化;3.Western Blot方法检测GSDME、GSDME-N、caspase-3、p17、caspase-1、p20、IL-1β以及m IL-1β在Ctrl组和DN组大鼠12周、16周、20周肾脏组织中的蛋白表达水平;免疫组织化学染色检测Ctrl组和DN组大鼠12周、16周、20周肾脏组织中GSDME、caspase-3、caspase-1以及m IL-1β的蛋白表达水平;4.ELISA方法检测Ctrl组大鼠和DN组大鼠12周、16周、20周静脉血中m IL-1β的蛋白浓度;5.TUNEL染色检测Ctrl组大鼠和DN组大鼠12周、16周、20周肾脏组织中肾脏组织中焦亡细胞的阳性率;6.相差显微镜观察高糖刺激的人肾小管上皮细胞(HK2细胞)和大鼠肾小球系膜细胞(RGMCs细胞)的形态变化;7.HK2细胞和RGMCs细胞经高糖刺激0、12、24、36、48 h,Real-Time PCR方法检测GSDME、caspase-3、caspase-1以及IL-1β的核酸表达水平;Western Blot方法检测GSDME、GSDME-N、caspase-3、p17、caspase-1、p20、IL-1β以及m IL-1β的蛋白表达水平;ELISA方法检测高糖刺激不同时间点的细胞培养上清液中m IL-1β的蛋白浓度;8.GSDME-si RNA、caspase-3-si RNA和caspase-1-si RNA干扰后高糖刺激48 h,Western Blot方法检测GSDME、GSDME-N、caspase-3、p17、caspase-1、p20、IL-1β以及m IL-1β的蛋白表达水平;ELISA方法检测细胞培养上清液中m IL-1β的蛋白浓度。结果 1.成功构建SD大鼠1型糖尿病肾病动物模型:DN组大鼠随机血糖高于16.7m M,可见“多尿”症状。DN组大鼠随机血糖浓度和24 h尿量明显高于Ctrl组大鼠,STZ注射8周后24 h尿蛋白明显升高,而体重明显低于Ctrl组大鼠;2.PAS染色结果表明,与Ctrl组相比DN组大鼠肾脏系膜扩张、细胞外基质积聚;HE染色结果表明,DN组大鼠肾脏组织结构紊乱、肾小管肥大和间质损伤;3.Western Blot方法检测发现,与Ctrl组相比DN组大鼠肾脏中caspase-3的活化体p17的蛋白表达水平呈时间依赖性显著升高,20周达到最高;GSDME的N末端裂解片段GSDME-N的表达在16周有所增加,在20周有显著增加;caspase-1的活化体p20的蛋白表达水平呈时间依赖性升高,20周达到最高;m IL-1β的蛋白表达水平在12周时显著升高,在16周和20周时明显降低。免疫组织化学染色发现,与Ctrl组相比DN大鼠肾组织中GSDME,caspase-3和caspase-1蛋白表达均增高,m IL-1β的蛋白表达水平在12周时显著升高,随后随时间的延长在16周和20周时降低;ELISA检测结果显示,DN组大鼠相较于Ctrl组大鼠16周和20周静脉血中m IL-1β的蛋白浓度明显增加;4.TUNEL染色结果显示,DN组大鼠20周肾脏组织中TUNEL阳性细胞数目增加;5.相差显微镜观察结果显示,高糖刺激48 h后与对照组(NG组)相比高糖组(HG组)HK2细胞和RGMCs细胞的形态明显肿胀,并在质膜上出现特征性大气泡;6.HK2细胞及RGMCs细胞经高糖刺激后caspase-3、GSDME、caspase-1和IL-1β的m RNA表达水平明显升高;Western Blot检测结果显示HK2细胞及RGMCs细胞经高糖刺激后,HG组GSDME-N、p17和p20的蛋白表达水平明显高于NG组;HG组m IL-1β蛋白表达水平在24 h增加到峰值后开始下降,与此同时相应细胞培养上清液中的m IL-1β浓度从36 h开始以时间依赖性的方式增加;7.与NC-si RNA组比,GSDME-si RNA干扰组的细胞内m IL-1β的蛋白水平增高,而相应的细胞培养上清液中m IL-1β的蛋白浓度降低;8.与NC-si RNA组相比caspase-3和caspase-1双干扰组中,GSDME-N、caspase-1和p20、caspase-3和p17的蛋白水平显著降低;细胞内m IL-1β的蛋白水平明显高于NC-si RNA组和caspase-1干扰组,低于caspase-3干扰组;caspase-3和caspase-1双干扰组中细胞上清液中的m IL-1β浓度均较其他组降低。结论 1.成功构建1型糖尿病肾病SD大鼠动物模型;2.糖尿病肾病中肾脏细胞发生了细胞焦亡,细胞焦亡引发m IL-1β的释放增加在糖尿病肾病的炎性相关发病机制中发挥重要作用;3.caspase-3裂解GSDME诱发细胞焦亡同时增加m IL-1β的释放是糖尿病肾病发病机制之一。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R587.2;R692.9
【部分图文】：

天津医科大学硕士学位论文图 1：STZ 诱导的 SD 大鼠 1 型糖尿病肾病动物模型的生物学特征a-b. Ctrl 组大鼠和 DN 组大鼠在 0、4、8、12、16 和 20 周的随机血糖水平和体重水平；c-e. Ctrl 组大鼠和 DN 组大鼠在 8、12、16 和 20 周尿糖、24 小时尿量和 24 小时尿蛋白水平。结果用均值±标准差（mean ± SD）表示，n≧5。*P<0.05（与 Ctrl 组比较）。2. 大鼠肾脏组织 PAS 染色和 HE 染色观察肾脏组织形态改变大鼠肾脏组织 PAS 染色结果显示 DN 组大鼠肾脏组织系膜扩张、局灶性肾小管肥大和细胞外基质积聚，而 Ctrl 组大鼠肾脏组织未观察到这些变化（图 2a）。另外 HE 染色显示, 与 Ctrl 组相比 DN 组大鼠肾脏出现了明显的组织结构紊乱、肾小管肥大和肾小管间质损伤（图 2b）。

2. 大鼠肾脏组织 PAS 染色和 HE 染色观察肾脏组织形态改变大鼠肾脏组织 PAS 染色结果显示 DN 组大鼠肾脏组织系膜扩张、局灶性肾小管肥大和细胞外基质积聚，而 Ctrl 组大鼠肾脏组织未观察到这些变化（图 2a）。另外 HE 染色显示, 与 Ctrl 组相比 DN 组大鼠肾脏出现了明显的组织结构紊乱、肾小管肥大和肾小管间质损伤（图 2b）。图 2a：Ctrl 组大鼠和 DN 组大鼠肾脏组织 PAS 染色（左：Ctrl 组；右：DN 组，400×）

Ctrl 组大鼠和 DN 组大鼠静脉血清中 mIL-1β的浓20 周 DN 组大鼠和 Ctrl 组大鼠血清中 mIL-1β的浓（mean ± SD）表示，n≧5。*P<0.05（与 Ctrl 组组织中免疫组织化学染色检测 caspase-3 mIL-1β的蛋白表达化学染色测定 DN 模型诱导后 12 周、16 周、20 中 caspase-3、GSDME、caspase-1 和 mIL-1β的蛋 Ctrl 组相比 DN 组大鼠肾脏中 caspase-3 的蛋白。DN 组大鼠肾脏中GSDME的蛋白表达与Ctrl 组 Ctrl 组相比 DN 大鼠肾脏中 caspase-1 的蛋白表达。然而，与 Ctrl 组相比，DN 组大鼠肾脏中 mIL-著升高，随后随时间的延长在 16 周和 20 周时降
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 热孜万古力·阿帕尔;吴红;;2型糖尿病肾病患者检测血清基质金属蛋白酶-10的意义[J];现代检验医学杂志;2016年03期

2 胡晓蓉;;糖尿病病人常见的饮食、运动误区[J];中国水电医学;2006年06期

3 赵玉馨;;糖尿病肾病61例临床分析[J];水电医学杂志;1995年01期

4 郑洁;;糖尿病肾病易患因素分析[J];中国水电医学;2003年02期

5 王超;;高频超声评价肾小球滤过率对2型糖尿病肾病患者颈动脉内-中膜厚度及颈动脉粥样硬化血管重构的影响[J];中国医疗器械信息;2019年21期

6 张帅;殷国泉;于春晓;高羽;徐娇阳;秦明明;路勇;浦春;;超氧化物歧化酶检测辅助诊断2型糖尿病肾病[J];牡丹江医学院学报;2019年06期

7 王小星;;糖通饮联合羟苯磺酸钙治疗2型糖尿病肾病早期疗效观察[J];中国社区医师;2019年32期

8 戴宁;张煜;马捷;吴凤芝;李傅尧;张睿;于姣姣;张炜悦;林炳岐;孙天石;张蔚;刘梦;李峰;;糖尿病肾病的中医治疗近况[J];吉林中医药;2018年12期

9 姜雪刚;韩春芳;;糖尿病肾病患者的预防与保健[J];中外女性健康研究;2019年01期

10 周素敏;肖艳;;糖尿病肾病中西医治疗研究进展[J];世界最新医学信息文摘;2018年A5期

相关博士学位论文 前10条

1 吴云鹏;补体C3复合物及补体C3酶促糖基化修饰与各类型糖尿病的联系[D];北京协和医学院;2019年

2 郝秋发;倍半萜内酯改善2型糖尿病肾病肾小管白蛋白摄取的机制初探[D];北京协和医学院;2019年

3 何清华;北京地区中老年2型糖尿病肌少症患病率和危险因素的研究[D];北京协和医学院;2019年

4 田东丽;腺苷1型受体在糖尿病肾病小管间质损伤中不依赖于管球反馈的机制初探[D];北京协和医学院;2019年

5 苏森森;2型糖尿病伴肾损害的临床及病理特征研究[D];吉林大学;2019年

6 陈梁凯;晚期糖基化终末产物及其受体与2型糖尿病的关联性研究[D];华中科技大学;2019年

7 王涛;遗传因素对体脂分布及糖尿病的关联研究[D];上海交通大学;2018年

8 章晓燕;糖尿病周围神经血管病变的血清标志物研究[D];上海交通大学;2016年

9 王二敏;LncRNA-Gas5/miRNA21 ceRNA调控网络在糖尿病肾病发病机制中的作用研究[D];中国医科大学;2019年

10 马超;基于Sirt1/NF-κB通路介导的炎症机制和脂代谢紊乱探究早期糖尿病肾病“气阴两虚、络脉瘀阻”病机的物质基础[D];浙江中医药大学;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 王子;体医结合模式下的综合运动干预对2型糖尿病患者血糖、血脂及体质健康的影响[D];上海体育学院;2019年

2 盛忠奇;糖化血红蛋白指数与2型糖尿病周围神经病变的相关性研究[D];扬州大学;2019年

3 侯伟华;糖化血红蛋白指数与2型糖尿病患者颈动脉内中膜厚度的相关性研究[D];扬州大学;2019年

4 孙娜;2型糖尿病患者首次短期胰岛素强化治疗对铁代谢指标的影响[D];承德医学院;2019年

5 郝冬冬;C肽与围绝经期女性2型糖尿病患者颈动脉粥样硬化的相关性研究[D];承德医学院;2019年

6 成海梅;糖尿病视网膜病变对2型糖尿病肾病诊断价值的中西医结合临床研究[D];广东药科大学;2019年

7 程力;阿托伐他汀在延缓早期2型糖尿病患者动脉粥样硬化形成中的疗效观察[D];吉首大学;2019年

8 赵远莹;移动医疗APP对糖尿病患者自我管理及血糖控制的影响研究[D];哈尔滨工业大学;2019年

9 郑菲菲;糖尿病肾病（肝肾阴虚挟瘀毒证）中医临床路径的应用评价[D];长春中医药大学;2019年

10 李佳盈;化浊安肾汤治疗糖尿病肾病（脾肾阳虚夹血瘀证）的临床观察[D];长春中医药大学;2019年

本文编号：2894390