β-catenin siRNA阻断Wnt/β-catenin信号通路对肾小管上皮细胞转分化的调控机制研究

发布时间：2021-03-08 07:30

　　目的通过沉默Wnt/β-catenin信号通路的核心蛋白β-catenin,探讨其与肾纤维化的关系,为慢性肾脏病的治疗提供理论依据。方法1、根据sh RNA设计原则,设计针对β-catenin基因的有效靶点,构建β-catenin基因特异性si RNA慢病毒载体,并用293T细胞转染法测定慢病毒滴度。2、设计四组（N=3）不同剂量的阴性慢病毒浓缩液,剂量分别为1×105 ifu、1×106 ifu、1×107 ifu、1.5×107 ifu,分别注射于大鼠肾脏被膜下,3天后杀鼠取新鲜肾组织制作冰冻切片,观察慢病毒的感染效率,为后续实验摸索注射的最佳剂量。3、128只雄性SD大鼠（8周龄、200-250g）随机分为4组:①模型组（UUO组,N=32）;②假手术组（Sham组,N=32）;③β-catenin基因沉默组（沉默组,N=32）;④阴性沉默组（阴性组,N=32）。分别于术后第3、7、10、14天每组各处死8只大鼠,收集肾组织标本,通过HE染色、Masson染色观察肾组织形态及肾纤维化改变;通过免疫组织化学染色检测α-SMA和β-catenin蛋白的表达部位;以及Western b... 

【文章来源】：福建医科大学福建省

【文章页数】：72 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
缩略词表
中文摘要
Abstract
前言
第一部分 β-catenin siRNA慢病毒载体制备
    前言
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
        1.2 实验方法
    2 结果
        2.1 表达Ctnnb1丰度较高的肾细胞
        2.2 酶切慢病毒载体鉴定
        2.3 双酶切线性化的载体和DNA片段连接后的PCR鉴定
        2.4 测序鉴定结果
        2.5 不同靶点分别感染 293T细胞后滴度测定（荧光法）
        2.6 PCR內源筛选有效靶点
        2.7 RNAi有效靶点慢病毒大量包装及RT-PCR再次验证
第二部分 β-catenin siRNA对EMT的影响
    前言
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
        1.2 实验方法
    2 结果
        2.1 造模后肾脏外观
        2.2 冰冻切片
        2.3 大鼠肾皮质病理HE及Masson染色
        2.4 免疫组织化学检测肾小管上皮细胞目的蛋白表达情况
        2.5 Western blot检测梗阻侧肾皮质目的蛋白相对表达量
        2.6 RT-PCR检测梗阻侧肾皮质目的基因mRNA表达
讨论
结论
参考文献
综述
    参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]siRNA沉默β-Catenin对肝星状细胞增殖和凋亡的影响[J]. 葛文松,吴建新,陈颖伟,范建高.  实用肝脏病杂志. 2011(02)
[2]Wnt信号通路的生物学效应及其与肺部疾病的关系[J]. 于晓敏,王辰,王军.  首都医科大学学报. 2009(02)
[3]wnt信号转导通路与肝纤维化[J]. 孙利兵,王尉平,顾振纶,蒋小岗,周文轩,郭次仪.  中国药理学通报. 2008(07)
[4]Epithelial to mesenchymal transition in the progression of tubulointerstitial fibrosis[J]. LI Min-xia LIU Bi-cheng Institute of Nephrology,Zhong Da Hospital,Southeast University,Nanjing 210009,China.  Chinese Medical Journal. 2007(21)

硕士论文
[1]阻断Wnt/β-catenin信号通路对肾小管上皮细胞转分化的作用[D]. 周宝尚.第三军医大学 2012
[2]慢病毒介导RNA干扰沉默蛋白激酶Cgamma基因对大鼠吗啡耐受的影响[D]. 刘峰.华中科技大学 2011



本文编号：3070667