携带人源化的绿色荧光蛋白膀胱癌组织特异性报告基因腺病毒的构建及鉴定

发布时间：2017-04-16 09:17

  本文关键词：携带人源化的绿色荧光蛋白膀胱癌组织特异性报告基因腺病毒的构建及鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:构建携带人源化的绿色荧光蛋白(hrGFP,humanizedgreen fluorescentprotein)膀胱癌组织特异性报告基因腺病毒载体Ad5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP,为检测膀胱癌循环肿瘤细胞提供了一种新的检测方法。方法:根据图谱选取BglII和PmeI两种限制性内切酶分别对pShuttle-CMV-IRES-hrGFP和pShuttle-PSCAE-UPII-E1A进行分步酶切,pShuttle-CMV-IRES-hrGFP酶切后获得IRES-hrGFP目的片段,pShuttle-PSCAE-UPII-E1A酶切后获得PSCAE-UPII-E1A目的片段,对IRES-hrGFP目的片段和PSCAE-UPII-E1A目的片段进行胶回收。将回收得的两个片段IRES-hrGFP目的片段和PSCAE-UPII-E1A目的片段使用T4连接酶连接,16°恒温箱过夜,连接液转化至DH5α感受态细胞中、涂板,16小时后选取阳性克隆,过夜摇菌,用菌液聚合酶链反应(PCR)、基因测序(IRES-hr GFP片段)鉴定新构建的穿梭质粒pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP。将pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hr GFP用酶PmeI线性化后,电击法转化到含pAdEasy的BJ5183感受态细胞,转化、涂板后选取阳性克隆,过夜摇菌,重组后的质粒Ad-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP经过酶切(PacI、BsphI)、菌液PCR鉴定正确后,通过脂质体lipfectamine2000转染至包装细胞HEK293,包装成膀胱癌组织特异性报告基因腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP。结果:pShuttle-CMV-IRES-hrGFP和pShuttle-PSCAE-UPII-E1A经过BglII和PmeI酶切后胶回收目的片段,将两个目的片段用T4连接酶连接,形成新的穿梭质粒pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP,新构建的穿梭质粒pShuttle-PSCAEUPII-E1 A-IRES-hrGFP经PCR鉴定和IRES-hr GFP基因测序鉴定,成功后利用细菌内同源重组法制备出组织特异性膀胱癌的腺病毒载体pAd-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP,经酶切和PCR鉴定后,通过脂质体转染至HEK293,荧光显微镜观察到hrGFP基因的表达,包装成报告基因腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP,经四轮扩增纯化后,测得病毒滴度为1.87×1011pfu/ml。结论:利用酶切从两个穿梭质粒中相应的获取所需的片段,通过连接反应形成新的pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP。细菌内同源重组法成功构建出pAd5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP重组腺病毒质粒。制备出的报告基因重组腺病毒为检测膀胱癌循环肿瘤细胞奠定了基础。
【关键词】：膀胱癌 循环肿瘤细胞 UPIIX启动子 人源化绿色荧光蛋白 重组腺病毒 HEK293细胞
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.14
【目录】：

• 英文缩写索引3-4
• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-14
• 材料和方法14-27
• 1.1 实验材料14-16
• 1.1.1 质粒、载体和细菌菌株14
• 1.1.2 主要实验试剂14
• 1.1.3 实验试剂盒14
• 1.1.4 仪器及设备14-15
• 1.1.5 主要溶液及配制15-16
• 1.2 实验方法16-27
• 1.2.1 引物设计与合成16-17
• 1.2.2 构建穿梭质粒pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP17-21
• 1.2.3 同源重组法制备重组质粒pAd5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP21-25
• 1.2.4 细胞培养及包装病毒25-27
• 结果27-29
• 2.1 穿梭质粒的鉴定pShuttle-PSCAE-UPII-E1A27
• 2.2 重组病毒质粒的鉴定pAd5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hr GFP27-28
• 2.3 转染48小时后、7 天后分别用荧光显微镜观察hr GFP基因表达情况28-29
• 讨论29-32
• 结论32-33
• 参考文献33-37
• 文献综述37-44
• 综述参考文献42-44
• 在校期间的研究成果44-45
• 致谢45

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本文编号：310505