尿道下裂患者包皮组织中雄激素受体基因启动子区甲基化状态研究

发布时间：2017-04-23 21:05

  本文关键词：尿道下裂患者包皮组织中雄激素受体基因启动子区甲基化状态研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:尿道下裂是由于阴茎尿道发育异常而导致的,是男性新生儿中最常见的生殖器发育畸形。尽管研究不断的深入,尿道下裂的病因仍就有许多的未知。然而,目前正处于尿道下裂病因学、流行病学和实验室研究的新的分水岭。据推测,由内源性或外源性因素导致,在阴茎和尿道发育关键期(8至14周)性激素浓度的变化,可能在尿道下裂的发生起一部分作用。因为某些内源性或外源性因素,如激素水平,饮食和接触化学物质可能会导致表观遗传改变,特别是在胎儿发育过程中,母亲所暴露的条件。本实验的研究目的在于探讨雄激素受体基因甲基化状态与表达情况以及双氢睾酮水平是否与尿道下裂的发生有关。方法:将15例尿道下裂患者作为实验组,15例年龄相似的包皮环切术患者作为对照组进行研究。1包皮组织以4%多聚甲醛溶液固定,常规制备病理切片,苏木精-伊红(HE)染色后观察组织病理变化。2检测各患者血清双氢睾酮水平。患儿血液经离心后,上清装入EDTA管中冻存在-20℃冰箱。使用双氢睾酮ELISA试剂盒(Diagnostic Biochem,加拿大)检测分析血清DHT浓度。血清DHT的检测灵敏度为6.0pg/ml。3我们使用实时MS-q PCR对亚硫酸氢钠处理过的DNA进行甲基化分析,因为这种技术是适合高度敏感和特异的甲基化检测。4使用TRIzol(Invitrogen公司)提取总RNA以Prime ScriptTM RT reagent KIT试剂盒(takara,日本)将m RNA逆转录成c DNA。以c DNA为模板,采用实时定量聚合酶链反应,检测AR-m RNA在包皮组织中的表达情况(上游引物5’-AAGGCTATGAATGTCAG CCCA-3’,下游引物5’-CATTGAGGCTAGAGAGCAAGGC-3’)。5提取组织在冰上匀浆提取总蛋白,BCA法测量各个组织的蛋白浓度,使用Western-Blot法分析包皮组织中AR基因蛋白的表达情况。结果:1通过HE染色法观察组织病理的改变,发现无论尿道下裂患者,还是包皮环切术的患者,组织表皮层都是角化的复层扁平上皮,上皮由上至下:角质细胞层、透明细胞层、颗粒细胞层、棘细胞层和基底细胞层,真皮层主要为结缔组织。只是相对于包皮环切术患者,尿道下裂包皮组织上皮基底层突触变多,部分位置棘层、颗粒层变薄,整体分布不均匀。2通过双氢睾酮ELISA试剂盒检测对血清DHT浓度的分析。发现尿道下裂患儿血清DHT水平明显低于包皮环切术患儿(22.17±5.1 vs.123.15±11.9 pg/ml,mean±SE;P0.05)。3通过MS-q PCR对包皮组织标本中AR基因甲基化的检测,发现尿道下裂患者包皮组织标本中AR基因甲基化程度高于包皮环切术患者。(甲基化百分比:64.1±3.7vs.50.9±2.4,mean±SE;P0.05)4通过q PCR对组织AR基因m RNA表达的检测,发现尿道下裂患者包皮组织标本中AR基因m RNA表达程度低于于包皮环切术患者。(RQ=0.198±0.028,mean±SE;P0.05)5通过Western-Blot法分析包皮组织中AR基因蛋白的表达情况,发现尿道下裂患者包皮组织标本中AR基因蛋白表达程度明显低于包皮环切术患者。(OD:0.254±0.288 vs.OD:1.355±0.154,mean±SE;P0.05)结论:多年来,遗传学的探索发现尿道下裂的新的候选基因都集中在DNA序列本身。虽然一些因素可能仍有待确定,可从本实验来看,DNA甲基化可能是尿道下裂患者在没有DNA序列变化的情况下出现异常的基因表达模式。新技术的改进,让DNA甲基化状态检测更方便快速,本实验是第一次在国内建立了雄激素受体甲基化状态检测的MS-q MSP方法。根据实验结果,得出以下结论:1尿道下裂患儿包皮组织,部分位置皮肤棘层、颗粒层变薄,整体分布不均匀,可能与AR受体表达的减少,尿道下裂的发生有关。2尿下裂患者血清DHT水平明显降低,可以作为尿道下裂临床诊断的一个新指标。3尿道下裂患者包皮组织AR基因甲基化状态高于包皮环切术患者,这可能是尿道下裂患者出现的表观遗传变异。4尿道下裂患者包皮组织AR基因的高甲基化状态,可能是引起组织m RNA及蛋白低表达的关键因素,与尿道下裂的发生具有一定意义。
【关键词】：尿道下裂 雄激素受体 表观遗传变异 DNA甲基化 双氢睾酮
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R695
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文缩写10-11
• 前言11-13
• 材料与方法13-24
• 结果24-26
• 附图26-28
• 附表28-29
• 讨论29-31
• 结论31-32
• 参考文献32-35
• 综述 尿道下裂病因学研究进展35-48
• 参考文献41-48
• 致谢48-49
• 个人简历49

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 安宇;刘雪辉;唐耘熳;刘竞;李俊;罗一钊;邱明星;;先天性尿道下裂和单纯性阴茎下曲患者阴茎皮肤组织中雄激素受体表达研究[J];中国修复重建外科杂志;2012年04期

2 何军;赵晓昆;徐冉;李远伟;王新君;;5a-还原酶的表达和睾酮测定与尿道下裂的关系[J];中国现代医学杂志;2007年08期

  本文关键词：尿道下裂患者包皮组织中雄激素受体基因启动子区甲基化状态研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：322992