自噬在衰老自发性高血压大鼠足细胞损伤中的作用研究

发布时间：2017-04-26 20:10

  本文关键词：自噬在衰老自发性高血压大鼠足细胞损伤中的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景原发性高血压是最常见的慢性非传染性疾病,其患病率、发病率及血压水平随年龄增加而升高。随着降压药的普遍应用,高血压引起的心脑血管并发症已明显下降,但由于高血压肾损伤引起的终末期肾脏疾病(end-stage renal disease, ESRD)比例却明显的增加。有临床横断面研究提示,至2012年,中国18岁以上人群中有1.2亿慢性肾脏病患者,高血压和糖尿病患病率的攀升将会导致慢性肾脏病的激增。据美国肾脏数据登记系统2013年的年度报告显示,2011年美国ESRD患者中约24.8%的原发病是高血压肾损伤,仅次于糖尿病肾病,自2000年以来比例增长了8.7%,这提示目前临床应用的降压药对于保护肾功来说还是远远不够的,因此进一步研究高血压肾损伤的发病机制,并针对性应用相关药物防治高血压肾损伤十分必要。“自噬”一词于1963年首次由诺贝尔奖获得者,de Duve用于描述胞内废弃细胞器被包裹于单层或双层膜结构中,进而被消化降解的这一现象。自噬通过降解细胞内多余的蛋白质、脂质、废弃细胞器达到清除废物、更新胞内物质、回收能源、营养,维持细胞内稳态的目的,是真核细胞高度保守的细胞适应机制,实验证明,抑制自噬可加速衰老,促进自噬可延长寿命,在自然衰老过程中,自噬活性逐渐降低。终末分化细胞如神经细胞、心肌细胞、肾小球足细胞等如果出现自噬缺陷可导致细胞内大量废弃蛋白、细胞器堆积,使得此类细胞无法有效地应对外界有害刺激。自噬的有利一面是得到充分验证的,但是自噬有其不利一面,某些疾病的死亡细胞中发现大量的自噬体,有学者认为是自噬导致细胞死亡,即通常所说的Ⅱ型程序性死亡,可能是由于过度降解细胞内组成物质而造成。肾小球足细胞参与肾小球滤过屏障的组成,无时无刻不与细胞毒性物质及炎症大分子接触,易发生氧化应激及脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)损伤,而肾小球足细胞损伤是包括高血压肾损伤在内多种肾脏疾病难以治愈的关键所在,严重的、进行性的足细胞损伤可导致肾小球硬化等多种肾脏病变,最终进入ESRD。作为终末分化细胞,足细胞与神经细胞、心肌细胞相似,主要是通过自噬而不是细胞分裂来减少胞内积累的损伤DNA和大分子物质,体外实验、动物实验、人肾活检均提示足细胞存在较高水平的基础自噬,且在维持足细胞的稳定中起到重要的作用。目前认为局部和/或循环系统肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin-system, RAS)的异常激活参于原发性高血压的发病及维持,而肾脏表达RAS所有成员,肾脏RAS对原发性高血压的发生发展起到重要作用,同时RAS中致血压升高的主要活性物质血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)可通过抑制足细胞足突重要组成蛋白nephrin的表达或促进氧化应激作用导致肾小球足细胞损伤,近年发现Ang Ⅱ可诱导足细胞自噬,尚不清楚Ang Ⅱ诱导足细胞自噬与Ang Ⅱ诱导足细胞损伤有何关联。目的观察正常血压衰老及高血压衰老时大鼠肾皮质RAS及肾小球足细胞自噬的变化,进一步探讨高血压衰老时肾损伤的可能机制,然后用血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin converting enzyme inhibitors, ACEI)贝那普利和Ang Ⅱ受体拮抗剂(Ang Ⅱ receptor blockers, ARB)氯沙坦分别干预老年自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR),观察贝那普利和氯沙坦对老年SHR肾小球足细胞自噬的影响,进一步探讨ACEI/ARB肾脏保护作用的新机制。方法(1)正常血压大鼠Wistar-Kyoto-rat (WKY)分为3、13、22月龄组,均有性别、月龄、数量相匹配的SHR作为对照。监测大鼠血压；检测尿蛋白、尿肌酐、血肌酐(serum creatinine,SCR)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血清和肾皮质肾素活性、Ang Ⅱ水平；观察肾组织光镜、透射电镜下形态学改变,计数足细胞内自噬体；western blot法检测肾小球Ang Ⅲ型受体(Ang Ⅱ type 1 receptor,AT1R)、AngⅡ2型受体(Ang Ⅱ type 2 receptor, AT2R)、 nephrin、Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5、p62表达情况。(2)18月龄雄性WKY为NORM组[生理盐水2ml/d],18月龄雄性SHR随机分为4组：CTRL组[生理盐水2mVd]、ACEI组[贝那普利10mg/(kg.d)]、ARB组[氯沙坦30mg/(kg.d)]、Combined组[贝那普利10mg/(kg.d)+氯沙坦30mg/(kg.d)],每组均为6只,实验干预4个月。定期监测大鼠血压；实验终点检测尿蛋白、尿肌酐、SCR、BUN.血清及肾皮质肾素活性、Ang Ⅱ水平；观察肾组织光镜和电镜下形态学改变,计数足细胞内自噬体；western blot法检测肾小球nephrin、 Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5和p62蛋白表达情况。结果(1)WKY及SHR血压随着月龄增加均无明显变化(P0.05),但SHR血压均明显高于同月龄WKY(P0.05)。(2)正常血压衰老及高血压衰老时,尿蛋白/尿肌酐比值均明显升高(均P0.05)SHR尿蛋白/尿肌酐比值均明显高于同月龄WKY(P0.05)。(3)正常血压衰老及高血压衰老时,SCR、BUN水平均无明显变化(均P0.05)；两组比较,仅3月龄、13月龄SHR的BUN水平分别明显高于同月龄WKY(均P0.05)。(4)正常血压衰老时,血清及肾皮质肾素活性、Ang Ⅱ水平差异无统计学意义(均P0.05)；高血压衰老时,血清及肾皮质肾素活性、血清Ang Ⅱ水平随增龄差异无统计学意义(均P0.05),但肾皮质Ang Ⅱ水平随增龄明显降低(P0.05)。(5)正常血压衰老及高血压衰老时肾脏均出现肾小球硬化、肾小管萎缩和间质纤维化等衰老病变,但以高血压衰老时病变更为严重；正常血压衰老时肾小球足细胞自噬体相对堆积。(6)正常血压衰老时肾小球AT1R、AT2R、Beclin 1蛋白表达无明显变化(P0.05), LC3B-Ⅱ、Atg5、p62蛋白表达明显增多(均P0.05)；高血压衰老时肾小球AT1R蛋白表达明显增多,AT2R、nephrin、Beclin 1、 LC3B-Ⅱ、Atg5、p62蛋白表达明显减少(均P0.05)。(7)药物干预后,4组SHR血压、尿蛋白/尿肌酐比值仍明显高于NORM组,但ARB组、Combined组血压、尿蛋白/尿肌酐比值明显低于CTRL组(均P0.05)。(8)药物干预后,各组SCR、BUN差异无统计学意义(均P0.05)。(9)药物干预后,CTRL组、Combined组肾皮质肾素活性明显低于NORM组(均P0.05)；Combined组血清Ang Ⅱ水平明显高于CTRL组(均P0.05)；4组SHR肾皮质Ang Ⅱ水平明显低于NORM组,ARB组肾皮质Ang Ⅱ水平明显高于CTRL组(均P0.05)。(10)药物干预后,4组SHR均可见肾小球缺血皱缩,足突融合、消失,灶性小管萎缩及间质纤维化,但以CTRL组病变较重,Combined组病变较轻,NORM组、Combined组足细胞内自噬体明显多于CTRL组(均P0.05)。(11)药物干预后,CTRL组nephrin、Beclin 1、LC3B-Ⅱ、Atg5、p62水平明显低于NORM组；ACEI组nephrin、Beclin 1、LC3B-Ⅱ、Atg5水平、ARB组和Combined组nephrin、Beclin 1、LC3B-Ⅱ、Atg5、p62水平均明显高于CTRL组(均P0.05)。讨论(1)本实验无论是正常血压衰老的WKY还是高血压衰老的SHR在结构上均出现肾小球硬化、肾小管萎缩和间质纤维化等衰老病理变化,但明显的SHR病变更加严重；功能上,WKY和SHR随着月龄的增加尿蛋白／尿肌酐比值明显上升,且SHR尿蛋白／尿肌酐比值明显高于同月龄WKY,说明衰老是肾脏结构变化、功能衰退的因素之一,而高血压则加重了这些衰变。(2)正常血压衰老时肾小球LC3B-Ⅱ、Atg5、p62表达明显上升,高血压衰老时肾小球Beclin 1、LC3B-Ⅱ、Atg5、p62表达明显下降,电镜所见正常血压衰老时肾小球足细胞自噬体堆积,说明WKY肾小球足细胞随增龄细胞内自噬体有所堆积,自噬活性是下降的,SHR肾小球足细胞自噬活性相对升高。(3)高血压衰老时肾小球nephrin表达明显少于同月龄WKY,电镜可见老年SHR足细胞足突明显融合脱失,可知高血压衰老时肾小球足细胞发生损伤。高血压衰老时肾皮质AngⅡ水平明显降低,肾小球AT1R蛋白表达明显增多,AT2R蛋白表达明显下降,足细胞自噬活性增高,推测高血压衰老时,Ang Ⅱ通过表达增多的AT1R持续刺激足细胞,诱导足细胞自噬活性保持在高水平或是过度增强,自噬降解包括nephrin在内的足细胞大分子结构蛋白过多,此类蛋白清除多于合成,足细胞就会发生损伤,这可能是高血压衰老时肾损伤的机制之一。(4) ACEI/ARB干预后,与CTEL组相比,ARB组、Combined组尿蛋白/尿肌酐比值明显降低,且ACEI组、ARB组、Combined组肾小球nephrin蛋白表达水平明显升高,光镜和电镜观察4组SHR中以Combined组肾脏病变较轻,提示ACEI/ARB对肾脏具有保护作用。(5) ACEI/ARB干预后,电镜所见ACEI组、ARB组、Combined组肾小球足细胞自噬体均增多,其中Combined组的明显多于CTRL组,结合western blot结果,提示ACEI/ARB干预后老年SHR肾小球足细胞自噬体有所堆积,自噬活性减弱。(6)结合本实验所见,得出以下推测：老年SHR肾小球足细胞自噬活性过度增强,包括nephrin在内的足细胞结构蛋白被过度降解而导致足细胞损伤,甚至是足细胞死亡,促进了高血压肾损伤的发生及发展；ACEI/ARB干预后,老年SHR足细胞自噬活性下调,nephrin等结构蛋白合成速度大于降解速度,大鼠肾脏显微结构病变缓解,肾功能有所改善。ACEI/ARB可能通过调控肾小球足细胞自噬途径起到了保护肾脏的作用,这一推测有待具体实验进一步验证。
【关键词】：高血压肾损伤 肾素-血管紧张素系统 足细胞 自噬 ACEI ARB
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R544.1;R692
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-20
• 材料和方法20-29
• 1. 材料和试剂20-22
• 2. 实验方法22-29
• 结果29-37
• 1. 大鼠血压情况29-30
• 2. 大鼠肾功能比较30-31
• 3. 大鼠血清及肾皮质肾素活性、AngⅡ水平比较31-32
• 4. 大鼠肾皮质PAS观察32-34
• 5. 大鼠肾皮质电镜观察34-35
• 6. 各组大鼠肾小球各指标蛋白表达的变化35-37
• 讨论37-43
• 小结43-44
• 参考文献44-49
• 综述49-58
• 参考文献54-58
• 中英文对照缩略词表58-59
• 攻读学位期间成果59-60
• 致谢60-61

【共引文献】

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本文编号：329139