不同转移潜能膀胱细胞株的定量蛋白质组与N-糖组分析

发布时间：2017-04-28 04:11

  本文关键词：不同转移潜能膀胱细胞株的定量蛋白质组与N-糖组分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：膀胱癌是泌尿系统中较常见的恶性肿瘤的一种,通常可以分为非肌层浸润性膀胱癌以及肌层浸润性膀胱癌这两种。目前临床使用的膀胱癌诊断标志物为组织多肽抗原和癌胚抗原,这两种肿瘤标志物的特异性较差,在多种癌症发生时都会升高。利用新技术和新方法开展膀胱癌研究,寻找和发现新的膀胱癌肿瘤标志物,对于膀胱肿瘤的早期诊断和分子靶向治疗都具有非常重要的意义。本研究首先运用细胞培养条件下稳定同位素标记技术(SILAC)技术对3株不同转移潜能膀胱癌细胞株HCV29,KK47和YTS1的蛋白质组进行相对定量分析。结果共发现了689种表达变化的蛋白,包括255种表达上调蛋白和434种表达下调蛋白。对这些表达变化的蛋白进行分析发现属于细胞结合和催化分类的蛋白最多。据国内外众多的文献报道,整合素是一类重要的跨膜糖蛋白,它能够与细胞外基质结合并参与许多生物过程,尤其是癌细胞的发展与转移。利用SILAC蛋白质定量技术,发现整合素α6在3株细胞中的表达比例约为1:18:14。通过western blotting,q PCR,细胞免疫染色和流式细胞术多种技术进行验证。同时使用临床组织基因芯片结果对比分析,结果表明,与正常膀胱表皮细胞HCV29相比,整合素α6在膀胱癌细胞中表达量均有明显的上升,且在非侵染性膀胱癌KK47细胞中的表达量最高。上皮间质转化模型EMT是指具有极性的上皮细胞在特定的生理和病理情况下转化成为具有迁移能力的间质细胞的过程,这一过程被认为是癌症发展和迁移的重要基本步骤。蛋白质的糖基化修饰异常改变在许多重大疾病中,特别是在膀胱癌等众多肿瘤的发展以及转移过程中都具有极其重要的意义。研究表明多种肿瘤形成的过程中细胞内的糖链发生了明显的改变,同时发现发生糖基化修饰改变的分子与恶性肿瘤细胞转移时细胞内的信号传导有关。在膀胱癌中,生物大分子的糖基化特别是蛋白质糖基化修饰的异常改变影响着癌细胞的侵袭和转移能力。本研究使用TGFβ处理膀胱正常上皮细胞HCV29建立EMT模型。经过TGFβ处理后的HCV29细胞表现出明显的间质细胞特征。通过凝集素芯片技术分析发现5种凝集素(UEA-I,BS-I,MAL-II,RCA120和PWM)识别的糖链表达上调,10种凝集素(PNA,GNA,SNA,NPA,PTL-II,DBA,PHA-E+L,DSA,PTL-I和GSL-I)识别的糖链结构下调。对EMT模型细胞进行MALDI-TOF/TOF质谱检测N-聚糖表达分析发现与正常细胞相比,处理后的细胞含有更多的高甘露糖型和杂合型N-聚糖,N-聚糖的岩藻糖化程度也更高。最后通过糖基因芯片技术分析发现,在处理的细胞中,基因hexb,fuca1,man2a1等5个N-聚糖合成相关基因的表达均是下调的。在癌症治疗的策略中,及时发现,及早治疗有利于增加癌症患者的存活率。目前的许多报道指出糖蛋白表达量及其糖基化修饰的改变常伴随着癌症的发展,因此从糖生物学角度研究膀胱癌具有重要意义。
【关键词】：膀胱癌 定量蛋白质组 N-聚糖 SILAC 整合素α6
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.14
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 绪论7-16
• 1.1 膀胱癌现状7
• 1.2 定量蛋白质组学7-9
• 1.3 蛋白的糖基化修饰9-12
• 1.4 上皮间质转化（EMT）12
• 1.5 整合素蛋白12-14
• 1.6 肿瘤生物标志物14
• 1.7 细胞模型14
• 1.8 立题依据与意义14-15
• 1.9 主要研究内容15-16
• 第二章 材料与方法16-23
• 2.1 实验材料16
• 2.1.1 细胞株16
• 2.1.2 主要试剂16
• 2.1.3 主要仪器16
• 2.2 实验方法16-23
• 2.2.1 细胞培养16-17
• 2.2.2 同位素标记细胞株17
• 2.2.3 细胞划痕实验17
• 2.2.4 蛋白提取17-18
• 2.2.5 蛋白免疫印迹18
• 2.2.6 实时荧光定量PCR18-19
• 2.2.7 细胞免疫荧光组化19
• 2.2.8 胶内酶解19
• 2.2.9 溶液内酶解19-20
• 2.2.10 MALDI-TOF/TOF质谱20
• 2.2.11 液质数据处理20
• 2.2.12 蛋白质定量数据处理20
• 2.2.13 流式细胞术20
• 2.2.14 蛋白功能分析和IPA分析20
• 2.2.15 凝集素芯片分析和数据分析20-21
• 2.2.16 细胞凝集素组化21
• 2.2.17 质谱鉴定N-聚糖21
• 2.2.18 糖链质谱数据处理21
• 2.2.19 LTQ Orbitrap液相串联质谱分析21-23
• 第三章 结果与讨论23-46
• 3.1 膀胱癌细胞系蛋白质组分析23-35
• 3.1.1 3株细胞的形态差异和生存习性的异同23
• 3.1.2 细胞同位素掺入率分析23-24
• 3.1.3 蛋白质定量数据24-29
• 3.1.4 定量数据分析29-30
• 3.1.5 蛋白功能分析30-31
• 3.1.6 蛋白功能网络分析31-32
• 3.1.7 蛋白质定量数据的验证32-33
• 3.1.8 细胞免疫染色33
• 3.1.9 小结33-35
• 3.2 整合素 α6 在膀胱癌细胞系中表达的差异35-37
• 3.2.1 定量蛋白质组研究表明整合素 α6 在KK47细胞株的中表达量最高35
• 3.2.2 蛋白质定量数据的验证35-36
• 3.2.3 细胞免疫组化实验验证整合素 α6 在活细胞中的表达情况36
• 3.2.4 小结36-37
• 3.3 膀胱上皮细胞HCV29发生EMT前后细胞N-聚糖的变化37-46
• 3.3.1 TGFβ 诱导的EMT细胞模型构建37-39
• 3.3.2 凝集素芯片结果39-40
• 3.3.3 EMT过程N-聚糖的改变40-44
• 3.3.4 糖基因芯片分析糖基因的表达44
• 3.3.5 小结44-46
• 第四章 主要结论与展望46-48
• 主要结论46-47
• 展望47-48
• 致谢48-49
• 参考文献49-55
• 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 徐晓恩;姜英华;施前;;肿瘤蛋白质组学:过去、现在和将来[J];癌症;2008年10期

2 丁明霞;李

本文编号：332102