PRP睾丸过表达转基因小鼠模型的建立

发布时间：2017-04-29 15:08

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【摘要】：实验目的：Proliferin related protein(PRP)是泌乳素家族成员,以往研究结果显示PRP仅表达于雌性,且高表达于妊娠后期的胎盘组织。我们课题组在前期实验中发现PRP也表达于雄性睾丸Leydig细胞,然而PRP在雄性生殖系统中的体内功能尚待进一步研究。PRP基因体外研究表明：PRP表达定位于睾丸Leydig细胞,间接参与睾酮产生,抑制细胞增殖,表明PRP与生殖功能有关；PRP表达量随年龄的增加而增加,具有延缓衰老和改善生殖功能效应的人参皂甙可显著下调老年组大鼠PRP表达量,表明PRP在生殖衰老中发挥着某种效应。为此,本研究拟通过建立PRP睾丸过表达的转基因小鼠,为深入研究PRP的体内功能奠定基础。实验方法：1.转基因pEGFP-PRP载体构建运用分子克隆技术制备pEGFP-PRP载体。启动子LHR以C57小鼠基因组为模板、目的基因PRP以C57小鼠cDNA为模板、SV40以实验室载体以为模板；将构建好的载体进行酶切鉴定,测序,纯化后备用。在PRP基因前引入Flag标签,便于鉴别外源PRP基因表达情况。2.显微注射法制备PRP过表达转基因小鼠准备好C57假孕母鼠、受精卵供体母鼠和C57种公鼠、C57结扎公鼠,运用原核显微注射的方法将pEGFP-PRP质粒注射入受精卵卵周隙内,选取显微注射后状态良好的受精卵将其移植入C57假孕母鼠输卵管内,等待其产仔鼠。3.PRP过表达转基因首建鼠的筛选与鉴定运用PCR结合产物测序方法筛选鉴定外源基因PRP在后代转基因小鼠体内的整合情况,以获得PRP过表达转基因首建鼠。4.PRP过表达转基因鼠繁殖与PRP表达情况检测分别将转基因首建鼠与C57野生型鼠合笼交配,获得F1代后,对转基因阳性雄性小鼠与同窝阴性雄性小鼠进行检测。运用PCR法检测PRP的表达量；运用免疫组化法检测PRP的表达定位情况；ELISA检测睾酮。实验结果：1.成功构建转基因pEGFP-PRP载体。2.通过原核显微注射的方法成功将载体pEGFP-PRP注入小鼠受精卵内,获得3只小鼠PRP雄性转基因首建鼠。3.免疫组化显示外源基因外源PRP特异表达于睾丸Leydig细胞,心、脑、肝、肾、脾组织均无表达,Western blot检测显示转基因小鼠睾丸PRP表达明显高于对照组。4.与对照组相比,PRP转基因小鼠的血清睾酮水平明显降低。实验结论：成功建立了PRP过表达转基因小鼠模型,为深入研究PRP体内功能奠定了基础。
【关键词】：PRP 过表达 转基因小鼠
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R-332;R698.2
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-15
• 第一部分 PRP睾丸过表达转基因小鼠模型的制备15-37
• 1 实验材料15-16
• 1.1 主要试剂15
• 1.2 实验动物15
• 1.3 仪器与设备15-16
• 2 实验方法16-29
• 2.1 载体构建16-17
• 2.2 目的片段的获取17-19
• 2.3 融合片段的获取19-21
• 2.4 EGFP片段的获取21-22
• 2.5 18T-EGFP载体构建22-25
• 2.6 pEGFP-PRP载体构建25-27
• 2.7 显微注射法制备转基因小鼠27-29
• 3 实验结果29-35
• 3.1 目的片段的获取结果29-30
• 3.2 融合片段的获取结果30
• 3.3 EGFP片段的获取结果30-31
• 3.4 18T-EGFP载体构建结果31-32
• 3.5 pEGFP-PRP载体的构建结果32-33
• 3.6 测序结果33-34
• 3.7 显微注射结果34-35
• 4 讨论35-36
• 5 小结36-37
• 第二部分 PRP过表达转基因小鼠繁殖与PRP表达情况检测37-50
• 1 实验材料37-38
• 1.1 实验动物37
• 1.2 主要试剂37-38
• 1.3 主要设备38
• 2 实验方法38-45
• 2.1 PCR法鉴定筛选PRP过表达小鼠38-40
• 2.2 PRP转基因小鼠的传代40
• 2.3 PRP转基因在睾丸中免疫组化检测40-42
• 2.4 外源PRP基因在睾丸中Western-blotting检测42-44
• 2.5 ELISA检测血清睾酮含量44-45
• 3 实验结果45-48
• 3.1 PCR初步筛选结果45-46
• 3.2 转基因阳性小鼠PCR产物测序结果正确46
• 3.3 免疫组化结果46-47
• 3.4 PRP蛋白表达水平47-48
• 3.5 ELIASA检测血清睾酮含量48
• 4 讨论48-49
• 5 小结49-50
• 全文总结50-51
• 参考文献51-55
• 文献综述55-63
• 参考文献59-63
• 致谢63

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本文编号：335124