细胞穿透肽原核表达文库的分析以及高丰度穿透肽的机制和功能研究

发布时间：2021-12-09 22:03

　　真核生物细胞膜是一种具有半透性的生物膜,构成了细胞内、外物质选择性交换的结构基础,因而对于维持细胞的生存和正常功能的发挥具有关键性作用。然而,由于存在着这一天然屏障,一些被证明具有良好治疗效果和疾病诊断价值的生物大分子,例如非脂溶性的蛋白、抗体、多肽、核酸、极性药物分子、探针以及显像剂等却很难到达细胞内发挥应有的作用。近十几年来,细胞穿透肽（cell-penetrating peptides,CPPs）陆续发现,并得到深入研究,这一领域开启了细胞内输送载体研究的新纪元,CPPs亦被证明是目前实现细胞内运输最为有效的手段之一。大量的研究证实,CPPs可以有效地将亲水性蛋白质、多肽、核酸、极性化学分子甚至量子点等,导入多种细胞中,不仅能够保证活性分子正常发挥作用,并且在一定浓度范围内不会造成细胞损伤。尤其是某些CPPs能够携带货物分子穿过血脑屏障、血睾屏障、胎盘屏障等人体重要的屏障系统发挥作用。因而,CPPs作为有效的细胞内转运工具,在细胞生物学、细胞免疫学、药物开发、基因生物治疗以及肿瘤靶向治疗等研究领域,均具有广阔而重要的应用前景。CPPs的发现为细胞膜结构和功能的研究提供了极佳的研究... 

【文章来源】：南方医科大学广东省

【文章页数】：139 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图１．细胞内吞的不同形式［Ｕ］??

图１－１?１０倍系列稀释噬菌体的滴度测定??Ｆｉｇ．?１－１?Ｔｉｔｅｒｉｎｇ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｐｈａｇｅ?ｉｎ?１０－ｆｏｌｄ?ｓｅｒｉａｌ?ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ??Ａ，?３?ｐｆｕ?ｉｎ?１０１１?ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ?ｐｌａｔｅ；?Ｂ，?２２?ｐｆｕ?ｉｎ?１０１０?ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ?ｐｌａｔｅ；?Ｃ，?１７６?ｐｆｕ?ｉｎ?１０９?ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ?ｐｌａｔｅ??１．３．２噬菌体肽库的筛选及富集效果分析??筛选过程中选择生长状态良好的细胞，同时严格控制每轮筛选时加入噬菌??体的数量，以保证稳定的筛选结果。通过统计每轮淘选前加入的嗟菌体量与洗??脱后的噬菌体量，计算回收率。比较４轮淘选后噬菌体回收率（如表１－１），可以??发现从第一轮至第四轮，能够内化Ｈｅｌａ细胞的噻菌体回收量逐轮递增，淘选所得??的噬菌体回收率逐步提高，内化入Ｈｅｌａ细胞中的噬菌体数目在第二、三和四轮筛??选后分别是上一轮次噬菌体数目的４．６３、１０．３５和８．４４倍。上述结果显示，通过４??轮的全细胞筛选，内化Ｈｅｌａ细胞的噬菌体得到了明显富集。??表１－１噬菌体随机７肽库的淘选和富集结果??Ｔａｂ．?１－１?Ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ?ａｎｄ?ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ?ｏｆ?ｐｈａｇｅ?ｄｉｓｐｌａｙ?７－ｐｅｐｔｉｄｅ?ｌｉｂｒａｒｉｅｓ??

第一章细胞穿透肽的禮菌体展示技术筛选??菌体空载体ＤＮＡ的ＰＣＲ产物大小为２５８ｂｐ，因此通过电泳检测可以达到区分并剔??除空噬菌体的目的。如图１－２中，泳道２、６、７为噬菌体空载体的ＰＣＲ产物，而１、??３、４、５、８、９和１０的模板为插入了片段的噬菌体。选取有插入片段的噬菌体克??隆，并对其ＰＣＲ产物进行直接测序。??Ｍ?１?２?３?４?５?ｄ?７?８?９?１０??ｂｐ??２０００??１５００??１０ｕｕ?ｋ??５００??４００丨??３００丨??２００?Ｉ??１００?Ｉ??图１－２噬菌体ＤＮＡＰＣＲ产物琼脂糖凝胶电泳图??Ｆｉｇ．?１－２?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｐｈａｇｅ?ＤＮＡ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ??Ｌａｎｅ?Ｍ，?ＤＮＡ?ｌａｄｄｅｒ；?Ｌａｎｅ?２，６，７，?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ｅｍｐｔｙ?ｐｈａｇｅ?ｖｅｃｔｏｒ；?Ｌａｎｅ?１，３，４，５，８，９，１０，??ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ｐｈａｇｅ?ｖｅｃｔｏｒ?ｗｉｔｈ?ｉｎｓｅｒｔ．??１．４讨论??噬菌体展示技术，是一种用于筛选功能性多肽的蛋白质组学常用生物技术［２３，??２４］。其原理是将编码多肽的ＤＮＡ片段与噬菌体衣壳蛋白编码基因进行重组，并??以融合蛋白的形式表达在噬菌体的表面。基于生物分子与靶分子的亲和力，通??过吸附－洗脱－扩增的重复过程，将含有能与靶分子特异结合的噬菌体从表达各种??外源蛋白的噬菌体库中筛选出来，然后进行富集、扩增及基因序列测定，从而??获得外源蛋白的氨基酸组成。在本实验中


本文编号：3531388