移植肾慢性排斥反应外周血miRNA表达谱筛查与靶基因预测

发布时间：2017-05-10 06:02

  本文关键词：移植肾慢性排斥反应外周血miRNA表达谱筛查与靶基因预测，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肾移植是治疗尿毒症的最佳手段,移植术后排斥反应的发生往往不可避免。随着移植配型技术的进步以及新型免疫抑制剂的开发使用,肾移植术后急性排斥反应的发生率显著下降,但慢性排斥反应仍然严重威胁着移植肾的长期存活。移植肾穿刺活检是诊断慢性排斥反应的金标准,但穿刺活检属于有创检查,存在一定的并发症,增加受者的心理及生理负担。常规生化检验与影像学检查无法确定是否存在慢性排斥反应,所以,临床上迫切需要寻找一种无创的、高敏感性、高特异性的生物学指标,能够实现慢性排斥反应的无创诊断。微小RNA(microRNA、miRNA)是一类内源性单链RNA,具有转录后调控基因表达的功能。miRNA在人体生长发育、细胞凋亡等各种病理生理过程中发挥重要的调控作用,人体内miRNA表达量的改变与各种生理和病理状态密切相关,比较不同状态下miRNA表达谱可以发现特征性表达的miRNA,这既是优良的疾病标志物,还可用作疾病的防治靶标及机制研究的切入点。目的：1、比较移植肾慢性排斥反应与术后稳定恢复受者外周血miRNA表达谱的不同,筛选出特征性表达的miRNA,为实现慢性排斥反应的无创诊断提供参考；2、预测特征性表达miRNA所调控的靶基因,为后续移植肾慢性排斥反应相关机制研究提供基础。方法：选择3例经移植肾穿刺病理明确诊断为“T细胞介导的慢性排斥反应”的受者为实验组,3例肾移植术后移植肾穿刺病理诊断无异常的受者为对照组。抽取两组受者外周静脉血,提取血液RNA,进行纯度及完整性检测、poly(A)加尾、Flash Tag Biotin HSR Ligation标记、Affymetrix-miRNA芯片杂交,扫描仪扫描芯片结果,进行芯片数据分析,比较两组miRNA表达谱差异,筛选出特征性表达的miRNA,运用TaqMan探针的方法进行实时定量荧光聚合酶链反应(qRT-PCR)验证芯片结果。采用mirecords数据库检索差异表达的miRNA调控的靶基因,初步分析靶基因分布特征。结果：1、两组血液样本总RNA浓度均大于34.9ng/ml,在260nm/280nm的吸收峰值均介于1.8-2.1；甲醛变性凝胶电泳结果显示两组样本均出现两条粗亮而浓的条带,最上面一条28S和下面一条18S,且28S条带的亮度几乎为18S的两倍。表明抽提的RNA纯度及完整性较好,质量检测合格,未出现明显降解及污染等迹象。2、miRNA表达谱芯片结果：Affymetrix-miRNA芯片总共检测了6658种miRNA在两组之间的表达差异情况,结果显示34种miRNA表达存在显著差异(p0.05)；其中12种表达上调,miR-4423-3p上调最明显(7.09倍),上调表达的miRNA多定位于1号和2号染色体；22种miRNA表达下调,miR-3613-5p下调最明显(0.08倍),下调表达的miRNA多定位于9号和14号染色体。3、实时荧光定量PCR结果：选取miR-4423-3p和miR-133a-3p进行实时荧光定量PCR验证,结果显示miR-133a-3p及miR-4423-3p表达差异倍数与芯片结果吻合,说明芯片检测结果可靠。4、靶基因查询显示差异表达的34种miRNA共调控约9003种靶基因表达,这些靶基因部分分布在炎症反应、血管再生、淋巴细胞活化、细胞增殖等方面。结论：肾移植慢性排斥反应受者外周血miRNA表达谱存在特征性改变,这些特征性miRNA所调控的靶基因与炎症、淋巴细胞活化、血管再生、纤维化等过程有关。这可能为临床寻找诊断慢性排斥反应的生物学标志物及慢性排斥反应相关发生发展机制的研究提供参考。
【关键词】：miRNA 肾移植 慢性排斥反应 靶基因 基因芯片
【学位授予单位】：福建中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R699.2
【目录】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-12
• 材料与方法12-19
• 1 病例来源12
• 2 主要仪器设备及试剂12-13
• 2.1 主要试剂12
• 2.2 主要仪器12-13
• 2.3 实验所需试剂配置及保存13
• 2.4 miRNA靶基因预测数据库13
• 3 实验方法与步骤13-19
• 3.1 血液样本的收集、处理与保存13
• 3.2 全血总RNA的提取及质量检测13-14
• 3.3 miRNA芯片杂交14-16
• 3.4 芯片数据分析16
• 3.5 实时荧光定量PCR(Taqman探针方法)16-18
• 3.6 靶基因预测18
• 3.7 统计学分析18-19
• 结果19-26
• 1 RNA质量检测结果19-20
• 2 miRNA杂交芯片质控检测结果20-21
• 2.1 核心质控检测20
• 2.2 参考质控标准20
• 2.3 芯片平均信号值与背景信号值20-21
• 2.4 miRNA芯片杂交信号扫描结果21
• 3 miRNA芯片结果21-23
• 4 实时荧光定量PCR结果23-24
• 5 靶基因预测结果24-26
• 讨论26-30
• 结论30-31
• 参考文献31-33
• 附录33-34
• 致谢34-35
• 文献综述35-40
• 参考文献38-40
• 作者简历40

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：354115