siRNA沉默人类血红素敏感基因-1对膀胱癌细胞的影响

发布时间：2017-05-11 15:12

  本文关键词：siRNA沉默人类血红素敏感基因-1对膀胱癌细胞的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景及目的世界范围内,膀胱癌(bladder cancer,BC)发病率居恶性肿瘤的第十一位,在男性排名第七位,女性排在第十位之后。在初步诊断中,大约70%至80%的膀胱癌是非肌层浸润性的膀胱癌(non muscle-invasive bladder cancer,NMIBC),其余的20%至30%是肌层浸润性的膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC)。虽然这两种膀胱癌从病理上分析都是膀胱尿路上皮起源的病变,但是它们有着明显不同的临床特点。而与人体其他的恶性肿瘤相比,非肌层浸润性膀胱癌患者的总体生存率相对较高,但是其中30%至50%的患者在切除原发肿瘤后具有复发的可能,还有10%至20%的NMIBC患者进展到MIBC。虽然在初诊时,只有20%的膀胱癌患者被诊断为MIBC,但是这些恶性肿瘤患者绝大多数都进展为死亡,此外将近50%的MIBC患者在初诊时已经发现了隐匿性远处转移[1]。NMIBC患者是否复发及进展到MIBC的高危因素,以及MIBC患者发生转移的预后都是我们临床工作者及实验者所关心及待解决的主要问题,所以膀胱癌早期诊断及治疗已变得尤为重要。人类血红素敏感基因1(heme-responsive gene 1,HRG-1)是我校实验室发现的一种与肿瘤细胞凋亡有关的新基因,是溶质转运蛋白家族48(solute carriers,SLC48)的唯一成员,主要与核内体相关联,将血红素从核内体运输进入细胞质。SLC48A1/HRG-1与V-ATP酶酸化内涵体相互作用,增加V-ATP酶的活性,其可介导增加细胞膜转运体和受体再循环。我校前期的研究发现HRG-1在前列腺癌组织中高表达,而在前列腺增生组织中低表达或者不表达,这也为我们提供了理论依据。文献报道HRG-1与V-ATP酶存在相互作用,而V-ATP酶参与了肿瘤的发生及侵袭,这也为我们研究膀胱肿瘤高复发提供了思路。本课题目的是探讨HRG-1在膀胱癌与膀胱正常组织中的表达情况,通过si RNA干涉技术,转染目的细胞,从而调节HRG-1在膀胱癌细胞中的表达情况,观察其对膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响,为临床上治疗及评估恶性肿瘤预后提供理论基础。研究方法及内容1、观察人类血红素敏感基因1(HRG-1)在正常膀胱组织和不同级别膀胱癌组织中的表达情况,分析HRG-1基因是否能为膀胱癌患者的诊断及治疗提供一定的依据。2、通过蛋白印迹法和实时定量PCR的方法,检测正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1及T24、5637、BIU-87三组膀胱癌细胞系中HRG-1基因表达情况,并筛选出HRG-1表达最高的一组膀胱癌细胞,作为后续研究所用细胞。3、用si RNA干涉技术将HRG-1 si RNA转染到膀胱癌T24细胞中,使用实时定量PCR和蛋白印迹法来检测HRG-1 si RNA在膀胱癌T24细胞中的表达变化。4、MTT法和流式细胞仪检测干涉HRG-1的表达对膀胱癌T24细胞的增殖及凋亡的影响。实验结果1、HRG-1在膀胱正常组织和膀胱肿瘤组织中的阳性表达率分别为25%(5/20)、71.8%(61/85)。HRG-1在膀胱肿瘤组织中的阳性表达率明显高于正常膀胱组织,并且HRG-1在膀胱组织中的表达情况与与肿瘤的病理分期呈正相关,但与患者的性别、年龄无相关性。2、通过免疫蛋白印迹法(Western-blot)和实时定量RT-PCR法对正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1及膀胱癌T24、5637和BIU-87细胞进行检测,发现HRG-1在正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1中的表达明显低于膀胱癌T24、5637和BIU-87细胞中的表达,且在三组膀胱癌细胞系中T24细胞中表达水平最高。3、HRG-1 si RNA能有效下调T24细胞中HRG-1的表达:经转染48 h后,收集细胞,提取蛋白及m RNA通过Western blot及real-time PCR检测转染si RNA组、NC组及未处理组T24细胞中HRG-1蛋白及m RNA水平,结果显示si RNA沉默组HRG-1蛋白及m RNA明显下调。4、下调HRG-1后T24细胞增殖能力减弱,通过MTT实验检测发现,转染HRG-1si RNA组细胞增殖速率比对照组及空白组细胞增殖速率慢,且在第48h后p0.01;下调HRG-1后T24细胞凋亡增加,通过流式细胞术检测转染HRG-1 si RNA 24h及48h后细胞凋亡情况,与对照组及空白组相比凋亡率明显增加。结论1、HRG-1在膀胱肿瘤组织中高表达,在正常膀胱组织中低表达甚至不表达,且表达情况与病理分期呈正相关,说明HRG-1的表达与膀胱肿瘤的恶性程度及进展密切相关。2、HRG-1在正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1中的表达明显低于膀胱癌细胞T24、5637及BIU-87中的表达,且下调膀胱癌T24细胞中HRG-1的表达后,细胞增殖能力下降,细胞凋亡率增加,说明下调HRG-1的表达可以抑制T24细胞的增殖、促进T24细胞的凋亡。
【关键词】：膀胱癌 HRG-1 siRNA 增殖
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.14
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 文献回顾14-21
• 实验一HRG-1 在膀胱组织中的表达分析21-27
• 1 材料21-22
• 2 方法22-24
• 3 结果24-25
• 4 讨论25-27
• 实验二siRNA沉默HRG-1 基因对膀胱癌T24细胞的影响27-37
• 1 材料27-28
• 2 方法28-31
• 3 结果31-35
• 4 讨论35-37
• 小结37-39
• 参考文献39-46
• 个人简历和研究成果46-47
• 致谢47

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本文编号：357517