雷帕霉素对葡萄糖诱导SD大鼠阴茎海绵体平滑细胞自噬与凋亡的影响

发布时间：2022-05-08 15:45

　　目的:观察雷帕霉素对葡萄糖诱导SD大鼠阴茎海绵体平滑细胞（CCSMC）自噬与凋亡的影响。方法:原代分离纯化鉴定CCSMC后分别用5.6、10、20、30、40 mmol/L葡萄糖处理CCSMC 48 h,mCherry-GFP-LC3B双荧光腺病毒转染细胞检测自噬流情况;Western印迹及PCR检测自噬相关指标、自噬相关基因5（ATG5）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）、P62、Beclin-1的蛋白和mRNA水平的变化;流式细胞术检测不同浓度葡萄糖处理后细胞凋亡情况,然后再检测用600 nmol/L雷帕霉素预处理2 h再用40 mmol/L葡萄糖处理CCSMC 48 h后自噬相关指标LC3、Beclin1、P62的蛋白和mRNA水平的变化以及细胞凋亡的变化情况。结果:mCherry-GFP-LC3B双荧光腺病毒转染及PCR、Western印迹均提示在不同浓度葡萄糖处理后均发生了自噬现象,随着葡萄糖浓度升高,在10 mmol/L葡萄糖组自噬现象最强（P<0.05）,之后随着葡萄糖浓度升高自噬现象逐渐减弱（P<0.05）;流式细胞术检测发现相对于5.6 mmol/L葡萄糖组... 

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【部分图文】：

CCSMC的鉴定

mCherry-GFP-LC3双荧光腺病毒转染在非自噬情况下以弥散的黄色荧光存在于细胞质内,在自噬情况下mCherry-GFP-LC3B则聚集在自噬体膜上,呈现黄色荧光斑点,而当自噬与溶酶体融合形成自噬溶酶体后,因GFP在酸性环境下发生淬灭,而呈红色斑点。共聚焦荧光显微镜观察发现与5.6 mmol/L葡萄糖组相比,10 mmol/L葡萄糖组细胞中自噬小体与自噬溶酶体均增加(P<0.01),而与10 mmol/L组相比,20 mmol/L葡萄糖组胞中自噬小体与自噬溶酶体若有下降,而30、40 mmol/L葡萄糖组细胞中自噬小体与自噬溶酶体呈显著下降减少(P<0.01)。见图2。2.3 Western印迹检测不同浓度葡萄糖干预CCSMC后自噬相关指标ATG5、Beclin1、LC3、P62蛋白水平变化情况

PCR检测提示与40 mmo/L葡萄糖组相比,雷帕霉素预处理组Beclin1 mRNA表达量明显增加(P<0.01)P62的mRNA表达量显著降低(P<0.01)。见图6。图4 雷帕霉素预处理CCSMC后自噬相关蛋白P62、Beclin1、LC3的变化

【参考文献】：
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本文编号：3651929