NFATs-ET1通路在肾癌细胞786O增殖和迁移中的作用及其机制

发布时间：2017-05-22 21:17

  本文关键词：NFATs-ET1通路在肾癌细胞786O增殖和迁移中的作用及其机制，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:前期研究发现具有中度成瘤性的人胚肾细胞(Human Embryonic Kidney 293cell,HEK293细胞)在静息状态下就存在NFATs的活化现象,且导入外源性CHP2基因可促进HEK293细胞中活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFATs)的活化及内皮素1(endothelin 1,ET1)的表达,促进肿瘤细胞的生长。我们的课题旨在分析不同癌细胞株中NFATs及ET1的表达差异,阐明与肾癌细胞786O增殖和迁移相关的NFATs亚型的种类及其组成性活化状态,并探讨NFATs组成性活化对肾癌细胞786O增殖和迁移的影响及其作用机制。方法:1.通过逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcriotion-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术检测不同癌细胞株中ET1及NFATs的m RNA表达水平,同时应用蛋白印迹(Western-blot)和核浆分离技术确定肾癌细胞786O和人胚肾上皮细胞HEK293中NFATs的蛋白水平的表达及核、浆分布情况;2.采用细胞计数和细胞增殖—毒性检测方法(CCK8)来比较肾癌细胞786O及HEK293细胞增殖能力的差别;3.借助划痕实验观察786O和HEK293细胞的迁移能力的差异;4.使用Ca N-NFAT通路阻断剂Cs A阻断钙调磷酸酶(Ca N)的活性,观察其对肾癌细胞786O和HEK293细胞的影响(包括ET1和NFATs m RNA和蛋白的表达水平、细胞增殖情况、细胞迁移和侵袭能力以及细胞的凋亡情况)。结果:1.NFATc1,NFATc3和ET1在不同癌细胞株中有表达,但不同癌细胞株中存在显著差异。2.NFATc1特异性表达于786O细胞中;NFATc3在786O中的表达比HEK293高约3倍,且NFATc3组成性活化程度高于HEK293;ET1特异性表达于HEK293中;3.786O细胞增殖能力明显大于HEK293,培养72h可见3倍以上差距;4.786O细胞的迁移能力比HEK293细胞强,培养12h即可见显著差异;5.用环孢素(Cs A)阻断钙调磷酸酶(Ca N)的活性,培养24h后,786O细胞中ET1 m RNA水平的表达下降4倍以上,且NFATc3的入核也有所减少;6.用环孢素(Cs A)阻断钙调磷酸酶(Ca N)的活性,786O细胞的增殖受到明显抑制,降低1倍左右,而HEK293细胞却几乎不受影响;786O的迁移速度也明显下降,培养12h即可见显著差异;用Cs A处理72h后,786O细胞的凋亡比例增加1倍,HEK293细胞却没有明显变化;同时,786O细胞的侵袭能力有显著地下降。结论:NFATc3的表达和组成性活化可能与肾癌细胞786O的增殖和迁移有关;NFATc3可能是通过促进内源性ET1的表达和抑制细胞凋亡两种途径促进肾癌细胞786O的增殖和迁移。
【关键词】：肾癌细胞786O 内皮素1 活化T细胞核因子 细胞迁移 细胞增殖
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.11
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 中英文缩略词表10-11
• 第1章 绪论11-18
• 1.1 内皮素（ETs）11-12
• 1.2 钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)12-14
• 1.3 活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFATs）14-15
• 1.4 ET1-CaN-NFATs15-18
• 第2章不同肿瘤细胞系中ET1 和NFATs的表达差异18-28
• 2.1 引言18
• 2.2 实验材料与方法18-26
• 2.2.1 实验材料18-19
• 2.2.2 不同肿瘤细胞细胞的复苏19-20
• 2.2.3 细胞培养及传代20
• 2.2.4 细胞冻存20
• 2.2.5 细胞RNA的提取20
• 2.2.6 RNA浓度测定及鉴定20-21
• 2.2.7 PT-PCR实验21-23
• 2.2.8 细胞中总蛋白的提取23
• 2.2.9 核浆分离技术提取浆蛋白和核蛋白23
• 2.2.10 蛋白浓度的测定23-24
• 2.2.11 蛋白印迹法即Western Blot检测目的蛋白的表达24-26
• 2.3 实验结果26-28
• 2.3.1 不同肿瘤细胞中NFATs和ET1 在mRNA水平的表达26
• 2.3.2 786O和HEK293 中NFATs在蛋白水平的表达和核浆分布26-28
• 第3章 786O与HEK293 在细胞增殖和迁移方面的差异28-31
• 3.1 引言28
• 3.2 实验材料与方法28-29
• 3.2.1 实验材料28
• 3.2.2 细胞增殖实验28
• 3.2.3 CCK8 实验28-29
• 3.2.4 划痕实验29
• 3.3 实验结果29-31
• 3.3.1 细胞增殖差异29-30
• 3.3.2786O细胞迁移能力大于HEK293 细胞30-31
• 第4章 CsA阻断CaN通路对 786O细胞的影响31-37
• 4.1 引言31
• 4.2 材料与方法31-33
• 4.2.1 实验材料31
• 4.2.2 RT-PCR实验31
• 4.2.3 Western-Blot技术检测CsA作用后NFATc3 在 786O胞核胞浆中的分布情况31-32
• 4.2.4 CCK8 技术检测32
• 4.2.5 软琼脂实验32
• 4.2.6 细胞凋亡实验32-33
• 4.3 实验结果33-37
• 4.3.1 CsA对ET1 和NFATc3 在mRNA水平表达的影响33
• 4.3.2 CsA对NFATc3 核浆分布的影响33-34
• 4.3.3 CsA对 786O和HEK293 细胞增殖能力的影响34
• 4.3.4 CsA对 786O细胞迁移能力的影响34-35
• 4.3.5 CsA对 786O细胞侵袭能力的影响35-36
• 4.3.6 CsA对 786O细胞凋亡情况的影响36-37
• 第5章 讨论37-40
• 第6章 全文总结40-41
• 致谢41-42
• 参考文献42-45
• 附录45-47
• 攻读学位期间的研究成果47-48
• 综述48-54
• 参考文献52-54

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 ;Endothelium-specific SIRT1 overexpression inhibits hyperglycemia-induced upregulation of vascular cell senescence[J];Science China(Life Sciences);2012年06期

2 马建辉;李鸣;张思维;那彦群;陈万青;;中国部分市县肾癌及泌尿系其他恶性肿瘤发病趋势比较研究[J];中华泌尿外科杂志;2009年08期

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本文编号：386912