去乙酰化酶SIRT3在草酸钙肾结石形成中的作用和机制研究

发布时间：2017-05-23 08:08

  本文关键词：去乙酰化酶SIRT3在草酸钙肾结石形成中的作用和机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的通过动物和细胞实验检测草酸钙晶体作用下肾小管上皮细胞SIRT3的表达变化,及其对氧化应激和细胞凋亡的影响,阐明SIRT3对草酸钙肾结石形成的影响及机制。方法构建草酸钙肾结晶小鼠模型,设置实验组和阴性对照组,Von Kossa染色检测小鼠肾脏钙盐沉积情况。通过两组小鼠肾脏组织的基因表达谱分析和文献回顾,筛选出差异表达关键基因Sirt3,并用q PCR和Western blot实验验证其表达水平。免疫组化检测两组小鼠肾脏组织SIRT3蛋白表达,HE染色和TUNEL实验检测两组小鼠肾脏组织凋亡的情况,检测两组小鼠肾脏组织活性氧的含量,ELISA实验检测两组小鼠血液和尿液中肌酐、尿素氮以及中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白水平。构建草酸钙肾结晶细胞模型(TCMK-1细胞),分别用0μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、1000μg/ml浓度的一水草酸钙晶体刺激细胞24小时、48小时及72小时,流式细胞仪检测细胞凋亡和坏死率的变化,检测细胞ROS含量的变化,Western blot检测细胞SIRT3蛋白表达的变化。通过质粒过表达细胞SIRT3,设置对照组细胞,使用1000μg/ml浓度的一水草酸钙晶体刺激细胞72小时后,检测细胞活性氧的含量,流式细胞仪检测细胞凋亡和坏死率。结果成功构建草酸钙肾结晶小鼠模型,实验组的12只小鼠均成功诱导出肾脏结晶。基因芯片分析结果显示草酸钙肾结晶小鼠和对照组间共有2425个差异表达基因,q PCR验证部分基因表达差异,结果显示草酸钙肾结晶小鼠肾脏组织内Sirt3、Nlrp6表达下调,Il 1beta、Nfκb 1、Stat3、Il 6表达上调;线粒体相关差异基因筛选显示草酸钙肾结晶小鼠肾脏组织Sirt3表达显著降低;Western blot实验显示草酸钙肾结晶小鼠肾脏组织内SIRT3蛋白表达明显降低。免疫组化实验显示草酸钙肾结晶小鼠肾小管上皮细胞SIRT3蛋白表达较对照组显著降低;HE染色显示草酸钙肾结晶小鼠肾脏皮质和髓质细胞呈现明显损伤及凋亡性改变,TUNEL实验显示草酸钙肾结晶小鼠肾脏组织皮质(45.6±10.2 vs.12.4±1.6,p0.001)和髓质(16.8±3.4 vs.4.6±1.8,p0.001)每高倍镜视野下平均凋亡细胞数明显高于对照组小鼠;Western blot实验显示草酸钙肾结晶小鼠肾脏组织SIRT3蛋白表达明显降低,伴有促凋亡蛋白Bax表达增加,抑制凋亡蛋白Bcl-2表达降低;ROS检测显示草酸钙肾结晶小鼠肾脏组织中ROS含量明显高于阴性对照组(41530 RFU vs.16440 RFU,p0.001);小鼠肾功能生化指标检测显示草酸钙肾结晶小鼠血液肌酐值(80.45±31.73 vs.29.72±16.48μmol/L,p0.05)和尿液肌酐值(184.00±116.41 vs.61.38±44.07μmol/L,p0.05)显著高于对照组小鼠;草酸钙肾结晶小鼠血液尿素氮值(30.46±9.44 vs.5.89±2.38 mmol/L,p0.001)和尿液尿素氮值(57.65±21.61 vs.37.76±8.07μmol/L,p0.05)显著高于对照组小鼠;草酸钙肾结晶小鼠血液中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白值与对照组小鼠无显著差异(273.45±17.45 vs.275.92±30.53 mmol/L,p0.05),而尿液中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白值显著高于对照组小鼠(239.54±19.42 vs.121.52±34.61μmol/L,p0.001)。在草酸钙肾结晶细胞模型中,草酸钙结晶诱导的细胞凋亡和坏死、活性氧增加具有浓度和时间依赖性;草酸钙结晶下调TCMK-1细胞SIRT3的表达具有浓度和时间依赖性。过表达SIRT3后,与对照组比较,TCMK-1细胞凋亡率(8.6±0.2%vs.5.3±0.4%,p0.001)、坏死率(18.2±0.6%vs.14.7±0.8%,p0.05)和ROS水平明显降低(1373RFU vs.530 RFU,p0.05)。结论草酸钙肾结晶通过下调肾小管上皮细胞去乙酰化酶SIRT3的表达,促进肾小管上皮细胞氧化应激水平升高、细胞凋亡和坏死增加,进一步促进草酸钙晶体在肾脏的沉积。
【关键词】：草酸钙结晶 细胞凋亡 氧化应激 SIRT3
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692.4
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 缩略词表9-10
• 前言10-12
• 第一部分 草酸钙肾结晶小鼠模型的构建及基因芯片分析12-25
• 1、材料与方法13-18
• 2、结果18-23
• 3、讨论23-25
• 第二部分 草酸钙肾结晶小鼠模型中SIRT3的作用研究25-36
• 1、材料与方法25-28
• 2、结果28-33
• 3、讨论33-36
• 第三部分 草酸钙肾结晶细胞模型中SIRT3的作用和机制研究36-46
• 1、材料与方法36-38
• 2、结果38-43
• 3、讨论43-46
• 小结46-47
• 参考文献47-51
• 综述 SIRT3在线粒体氧化应激中的调节作用51-63
• 参考文献60-63
• 在读期间发表论文情况63-64
• 致谢64

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