短肽B04对前列腺癌转移相关蛋白ATP5B特异性抑制作用的研究

发布时间：2017-05-27 07:04

  本文关键词：短肽B04对前列腺癌转移相关蛋白ATP5B特异性抑制作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：前列腺癌是男性泌尿系统和生殖系统最常见的癌症,当发生局部侵犯和远处转移后将很难治疗。因此,阐明新的前列腺癌转移机制以及识别高转移潜能前列腺癌的潜在诊疗靶点是十分必要的,而迄今为止与前列腺癌转移密切相关的特异性蛋白尚未见报道。因此在本实验中,我们旨在发现和鉴定前列腺癌高转移相关膜蛋白。在本课题组前期实验中,我们选用前列腺癌高转移细胞系PC-3M细胞、前列腺癌低转移细胞系PC-3细胞和正常前列腺上皮细胞通过噬菌体七肽库进行差减筛选,得到了只与PC-3M特异性结合的转移相关短肽B04,并且发现短肽B04能够有效抑制PC-3M细胞的增殖和转移。随后,通过蛋白质组学等方法检测到了短肽B04的受体蛋白为PC-3M细胞膜上的ATP5B。本研究旨在验证ATP5B是否在PC-3M细胞的细胞膜上表达以及B04能否通过特异性抑制PC-3M细胞膜上表达的ATP5B来抑制其侵袭能力,并进一步检测短肽B04对HUVEC成管能力的影响。实验结果:1.ATP5B在高级别前列腺癌组织中的表达及定位采用免疫荧光组织化学双重染色的方法对ATP5B及E-Cadherin两种蛋白在高级别前列腺癌组织(临床分期IV期)中进行双重染色,E-Cadherin为上皮组织中细胞膜上表达的钙粘蛋白,主要作用是对ATP5B的表达进行共定位检测。实验结果显示:ATP5B在高级别前列腺癌组织的细胞浆及细胞膜上均表达阳性。2.ATP5B在前列腺癌高转移细胞系PC-3M细胞及前列腺癌低转移细胞系PC-3中的表达及亚细胞定位采用免疫荧光细胞化学双重染色方法对ATP5B及E-Cadherin两种蛋白在前列腺癌高转移细胞系PC-3M细胞和前列腺癌低转移细胞系PC-3细胞中进行双重染色。结果显示:ATP5B在PC3M的细胞浆和细胞膜中均有表达,而在PC3细胞中,ATP5B的阳性颗粒只存在于其细胞浆中;进而采用免疫电镜技术对ATP5B在PC-3M和PC-3两种细胞中的表达进行精确的亚细胞定位。电镜结果显示:在PC-3M细胞膜上可见到阳性胶体金颗粒,但在PC-3细胞膜上未见到胶体金颗粒。随后进一步采用流式细胞术、Western blot等方法检测ATP5B在PC-3M和PC-3细胞膜上的表达量。流式细胞术实验结果显示:ATP5B在PC-3M和PC-3细胞的细胞膜上阳性表达的百分比及荧光强度分别为61.68%±3.94%vs20.10%±1.79%,53.87±5.14vs17.46±0.31,且统计学分析显示,两种细胞细胞膜上ATP5B阳性表达的百分比及荧光强度比较差异均具有统计学意义(P0.05)。Western blot结果显示:PC-3M和PC-3细胞膜蛋白中ATP5B蛋白与内参GAPDH条带灰度的相对值分别为0.428±0.075和0.161±0.065,且两组间相对值比较差异具有统计学意义(P0.05)。以上结果表明ATP5B在PC-3M细胞膜上有表达,且在PC-3M细胞膜上的表达量明显高于PC-3细胞。3.短肽B04与PC-3M细胞膜上的ATP5B特异性结合采用流式细胞术、real time PCR和Western blot等方法进一步研究短肽B04与PC-3M细胞膜上的ATP5B能否特异性结合。流式细胞术实验结果显示:用短肽B04预孵育PC-3M细胞后,PC-3M细胞膜上ATP5B阳性表达的百分比为17.23%±1.13%,明显低于PC-3M空白组ATP5B阳性表达的百分比61.25%±2.56%,且两组之间比较差异具有统计学意义(P0.05)。real time PCR结果显示:用短肽B04预孵育PC-3M细胞后,PC-3M细胞中的ATP5Bm RNA与内参GAPDH m RNA相对值由1.00±0.03升高至1.34±0.06,且两者之间比较差异有统计学意义(P0.05)。Western blot实验结果显示:用过量的短肽B04与含有PC-3M细胞总蛋白的PVDF膜预孵育后,再加入ATP5B的特异性抗体孵育后无条带显示。以上结果说明短肽B04与PC-3M细胞膜上的ATP5B特异性结合。4.B04通过封闭PC-3M细胞膜上表达的ATP5B降低PC-3M细胞的侵袭能力采用Transwell侵袭实验检测与短肽B04共孵育对PC-3M细胞侵袭能力的影响。实验结果显示:用短肽B04封闭PC-3M细胞表面的ATP5B后,PC-3M细胞发生侵袭的细胞数为7.83±1.31,明显低于PC-3M空白组发生侵袭的细胞数45.67±4.32,且两组间发生侵袭细胞数的比较差异有统计学意义(P0.05)。5.短肽B04对HUVEC成管能力的影响采用内皮细胞管型形成实验检测短肽B04对HUVEC小管形成能力的影响;实验结果显示:短肽B04与HUVEC共孵育后,HUVEC的成管能力明显下降。以上实验结果说明了ATP5B在前列腺癌高转移细胞系PC-3M细胞膜上高表达,转移相关短肽B04通过特异性抑制膜上的ATP5B的功能来抑制PC-3M细胞的侵袭能力和HUVEC细胞的成管能力,以上结果也进一步说明了前列腺癌高转移细胞系PC-3M细胞膜上高表达ATP5B可能与促进前列腺癌的高转移能力相关,提示了ATP5B可能为高转移肿瘤的潜在生物学标志和治疗靶点。
【关键词】：前列腺癌 ATP5B 转移 膜蛋白
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 第1章 绪论14-19
• 1.1 肿瘤的侵袭与转移14-15
• 1.2 ATP5B的研究进展15-18
• 1.2.1 ATP5B亚基的异位表达15-16
• 1.2.2 异位ATP5B与肿瘤16-17
• 1.2.3 异位ATP5B与血管新生17-18
• 1.3 本研究拟解决的问题及项目创新点18-19
• 第2章 材料和方法19-30
• 2.1 实验材料19-22
• 2.1.1 主要试剂19-20
• 2.1.2 主要仪器20-21
• 2.1.3 主要溶液21-22
• 2.1.4 细胞培养条件及来源22
• 2.2 实验方法22-30
• 2.2.1 免疫荧光组织化学双重染色22-23
• 2.2.2 细胞免疫荧光染色23-24
• 2.2.3 Western blot24-26
• 2.2.4 细胞免疫电镜染色26
• 2.2.5 流式细胞术26-27
• 2.2.6 逆转录实时定量PCR27-28
• 2.2.7 Transwell侵袭实验28
• 2.2.8 HUVEC成管实验28-29
• 2.2.9 数据处理29-30
• 第3章 结果30-41
• 3.1 ATP5B在高级别前列腺癌组织中的表达及定位30-31
• 3.2 ATP5B在前列腺癌高转移细胞系PC-3M细胞及前列腺癌低转移细胞系PC-3 中的表达及亚细胞定位31-34
• 3.2.1 细胞免疫荧光双染检测ATP5B在PC-3M和PC-3 两种细胞中的表达31-32
• 3.2.2 免疫电镜技术对ATP5B在PC-3M和PC-3 两种细胞中表达的亚细胞定位32
• 3.2.3 Western blot对ATP5B在PC-3M和PC-3 细胞膜中表达的半定量检测32-34
• 3.2.4 流式细胞术对ATP5B在PC-3M和PC-3 细胞膜中表达量的检测34
• 3.3 短肽B04与PC-3M细胞膜上的ATP5B特异性结合34-38
• 3.3.1 短肽B04与PC-3M细胞膜上的蛋白结合34-35
• 3.3.2 与短肽B04孵育后，PC-3M细胞膜上ATP5B的阳性率明显下降35-37
• 3.3.3 B04与ATP5B特异性结合37
• 3.3.4 与短肽B04孵育后，PC-3M细胞中ATP5B的m RNA升高37-38
• 3.4 B04通过封闭PC-3M细胞膜上表达的ATP5B降低PC-3M细胞的侵袭能力38-39
• 3.5 短肽B04对HUVEC成管能力的影响39-41
• 第4章 讨论41-45
• 4.1 噬菌体展示肽库在识别肿瘤转移相关蛋白中的适用性41-42
• 4.2 ATP5B的异位表达42
• 4.3 异位表达的ATP5B的功能42-43
• 4.4 异位ATP5B调节细胞生物学行为可能的信号通路43-45
• 第5章 结论45-46
• 参考文献46-51
• 作者简介51-52
• 致谢52

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