miR-155在糖尿病肾病发病中的作用研究

发布时间：2017-06-05 12:12

  本文关键词：miR-155在糖尿病肾病发病中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景和目的近年来,随着全球范围内糖尿病发病率的不断增加,在西方国家,糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)已成为导致终末期肾脏病(End-stage renal disease,ESRD)的首要病因,也是引起糖尿病患者死亡的主要原因。在我国,这一比例也在逐年递增。肾小球肥大是DN最为突出的早期表现,系膜基质增多、系膜区增宽,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)异常积聚及由此导致的肾小球硬化和肾小管间质纤维化是DN进展的关键特征。然而,迄今为止,DN的发病机制仍不完全清楚,现有的治疗手段尚不足,因此,探讨DN的发病机制、寻找DN新相关致病基因,将对临床预防、诊断和治疗DN具有重要意义。micro RNA(miRNA)是人类新近发现的一类长约21~24bp的内源性、非编码单链小RNA,通过与靶mRNA的3'端非翻译区(3'-UTRs)序列配对互补结合,在转录后水平引起靶mRNA降解和(或)蛋白翻译抑制而参与生物体的多种生理及病理过程。血清、血浆、尿液等多种体液中发现的miRNA是细胞外miRNA的特殊存在方式,具有体液循环中的稳定性、细胞间的穿梭性以及不同组织来源的特异性等特点,使得体液miRNA有望作为一种新的生物标志物,从而有助于疾病的早期诊断、临床疗效及预后状况的评估。目前,已有大量的研究报道,多种miRNA与DN的发生、发展密切相关。然而,其参与DN发病的具体病理机制尚不十分明确,仍需有待于进一步研究。在课题组前期研究中,通过miRNA芯片、RT-PCR等方法对2型DN患者血清miRNA表达谱分析发现,miR-155在DN患者血清中的表达水平显著异常,提示miR-155可能与DN发病有关。应用生物信息学方法,并结合文献检索发现miR-155的目标靶基因为转录调节因子-1(ETS1),后者在基质金属蛋白酶(MMPs)参与基质调控中起关键性作用。为此,本研究选择糖尿病肾病背景下的db/db小鼠,通过动态观察miR-155及其靶基因ETS1在DN小鼠血清或肾组织中的表达变化,以探讨DN发展过程中miR-155与ETS1和肾组织病理学特征的关系。研究对象和方法选取4周龄的2型糖尿病肾病db/db小鼠(实验组),同周龄db/m小鼠(对照组)作为实验动物对象,分别检测各组、各时段小鼠血清mir-155、肾组织mir-155和靶基因ets1的动态表达变化,并明确分析mir-155与肾组织病理学特征和临床生化指标的相关性。1.生化指标检测每周监测小鼠的随机血糖,在4、8、12、16周龄时,随机抽取对照组和模型组小鼠各5只,记录各组小鼠体重(bw),留取血标本和24h尿液,并检测血肌酐(scr)、尿素氮(bun)和24h尿蛋白量(uae)变化。2.肾脏组织形态学观察通过he、pasm和masson染色,光镜下观察各组小鼠肾组织的病理学改变,以明确db/db小鼠dn的病理进展过程。3.mir-155和ets1mrna的表达采用实时荧光定量rt-pcr法检测两组小鼠血清mir-155、肾组织mir-155和靶基因ets1表达的动态变化。4.ets1蛋白的表达采用免疫组织化学染色法观察靶蛋白ets1在各组、各时段小鼠肾脏组织的表达和分布情况。研究结果1.db/db小鼠生化指标变化4周龄db/db小鼠出现肥胖,bw增加(p0.05),而glu、scr、bun及uae水平虽有所升高,但与db/m对照组比较,差异均无统计学意义(p0.05)。8周龄时,db/db小鼠bw、glu、scr和bun均明显增高(p0.05,p0.01),并出现了蛋白尿,说明此时db/db小鼠已发生dn。此后,随周龄的增加,db/db小鼠glu、scr、bun及uae水平进一步增高(p0.05,p0.01)。2.db/db小鼠肾组织病理改变he、pasm和masson染色显示,不同周龄的db/m小鼠肾小球及系膜区未见明显异常改变。db/db小鼠4周龄时,其肾脏未见明显异常,8周龄后,出现肾小球肥大、系膜细胞增多,伴毛细血管基底膜增厚。达16周龄时,可见肾小球与bowman囊的壁层有黏连,出现病变肾小球系膜基质增生和硬化,伴节段性肾小管扩张、萎缩、肾间质内炎性细胞浸润及纤维化形成。3.db/db小鼠肾组织、血清mir-155表达rt-pcr检测结果显示,与同周龄db/m相比,4周龄db/db小鼠的肾脏mir-155水平未见明显变化(p0.05),8周龄小鼠肾组织mir-155表达显著高于同周龄的db/m小鼠,随周龄的延长,mir-155表达明显升高(p0.05)。与肾脏中的表达结果相一致,8,12,16周龄db/db小鼠血清mir-155的表达均高于同周龄的db/m小鼠,且随周龄的延长,mir-155表达亦逐渐升高(p0.05),而同周龄db/m小鼠则无明显变化。4.db/db小鼠肾组织ets1mrna表达与同周龄db/m小鼠相比,8、12及16周龄db/db小鼠肾脏ets1mrna表达明显降低,且随周龄的增加,ets1mrna的表达呈下降趋势(p0.05)。5.db/db小鼠肾组织ETS1蛋白表达免疫组化染色显示,ETS1主要定位于肾小球内皮细胞、足细胞和肾小管上皮细胞。与同周龄db/m小鼠比较,4周龄db/db小鼠肾脏中ETS1表达量未见明显差异,但8周龄db/db小鼠肾组织ETS1表达减弱。随周龄的增加,ETS1表达染色呈减弱趋势。6.db/db小鼠血清miR-155表达与生化指标的相关性相关性分析显示,db/db小鼠血清miR-155表达,分别与Scr、BUN、UAE的水平呈明显相关性。结论1.miR-155在db/db小鼠血清和肾组织中表达增高,并且随DN的进展,miR-155水平呈进行性升高。提示miR-155可能参与了DN的发病机制,血清miR-155有可能作为DN早期诊断的筛查指标。2.db/db小鼠肾组织中ETS1mRNA和蛋白的表达降低,其表达水平随DN的进展呈下降趋势。提示miR-155可能通过调控ETS1而参与DN的发生、发展。
【关键词】：糖尿病肾病 micro RNA miR-155 db/db小鼠 ETS1
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R692.9
【目录】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-11
• 前言11-15
• 实验动物、仪器及试剂15-17
• 1 实验动物15
• 2 主要实验仪器15-16
• 3 主要药物及试剂16-17
• 实验方法17-27
• 1 实验动物饲养及分组17
• 2 实验动物标本采集及处理17
• 3 各项生化指标的检测17
• 4 肾脏病理形态学观察17-19
• 4.1 苏木精-伊红（HE）染色18
• 4.2 过碘酸-六胺银（PASM）染色18-19
• 4.3 Masson染色19
• 5 RT-PCR法检测肾组织和血清miR-155的表达19-23
• 5.1 miRNA的提取及纯化19-21
• 5.2 Poly(A)加尾和逆转录合成cDNA21-22
• 5.3 RT-PCR反应22-23
• 6 RT-PCR法检测肾组织ETS1mRNA的表达23-25
• 6.1 肾组织总RNA的提取及纯化23
• 6.2 逆转录合成cDNA23-24
• 6.3 RT-PCR反应24-25
• 7 免疫组织化学法检测肾组织ETS1蛋白的表达25-26
• 8 统计学分析26-27
• 实验结果27-35
• 1 一般情况观察27
• 2 db/db小鼠生化指标的变化27-28
• 3 db/db小鼠肾组织的病理改变28-30
• 4 db/db小鼠肾组织和血清miR-155的表达30-32
• 4.1 提取RNA浓度和纯度的检测30
• 4.2 肾组织miR-155的表达30-31
• 4.3 血清miR-155的表达31-32
• 5 db/db小鼠肾组织ETS1mRNA的表达32-33
• 6 db/db小鼠肾组织ETS1蛋白的表达33
• 7 db/db小鼠血清miR-155的表达与生化指标的相关性33-35
• 讨论35-38
• 结论38-39
• 参考文献39-42
• 英文缩写注释表42-43
• 文献综述43-51
• 参考文献50-51
• 在校期间的研究成果51-52
• 致谢52

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本文编号：423708