肾康注射液抑制高糖诱导肾小管上皮细胞应激性衰老

发布时间：2017-06-05 12:15

  本文关键词：肾康注射液抑制高糖诱导肾小管上皮细胞应激性衰老，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景与目的糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是导致终末期肾功能衰竭的主要原因。肾小管间质在DN进展中扮演了重要角色,近端肾小管上皮细胞作为最易受损的肾实质细胞,在葡萄糖代谢紊乱环境中极易发生缺氧,氧化应激损伤,表现为先增生后肥大继而应激性衰老。近期大量研究表明,DN早期患者肾组织中便出现衰老肾小管上皮细胞,同时在糖尿病早期大鼠模型肾组织中也有大量衰老肾小管上皮细胞,体外实验亦证实高糖可加速肾小管上皮细胞应激性衰老,说明肾小管上皮细胞应激性衰老是DN肾小管间质损伤早期的重要细胞生物学事件。研究发现衰老的肾小管上皮细胞与肾小管萎缩,肾间质炎症,肾间质纤维化,及肾功能密切相关,并且衰老的肾小管上皮细胞可增加肾脏对损伤刺激的易感性,抑制正常细胞增殖从而阻止受损肾脏的修复。因此肾小管上皮细胞应激性衰老在DN进展中扮演了重要角色,防治肾小管上皮细胞应激性衰老可能是延缓DN进展的一个新策略。经典方药肾康注射液是由黄芪、大黄、丹参和红花四种中药组成的复方制剂。肾康注射液(国药准字Z20040110),于1999年经国家食品药品监督管理局批准(YBZ08522004)用于治疗慢性肾脏病。经过大量临床试验研究,发现肾康注射液可明显降低CKD患者的血肌酐,尿素氮水平,保护残余肾功能,具有良好的有效性,安全性和远期疗效。体内外研究均发现肾康注射液可以显著抑制肾脏氧化应激损伤,抑制肾间质纤维化。已有体外研究证明肾康注射液能够显著抑制高糖诱导后系膜细胞肥大和P21表达等衰老细胞特征样改变,提示肾康注射液具有抑制高糖诱导系膜细胞衰老的作用。因此,我们的研究关注肾康注射液是否具有抑制高糖诱导肾小管上皮细胞衰老的作用及机制。研究方法1.原代肾小管上皮细胞提取及鉴定1.1取3周龄雄性C57小鼠断颈处死,无菌获取双肾,去除肾包膜和肾蒂组织,加入II型胶原酶37°消化30min,通过双重过滤(依次通过250uM和80uM筛网),置入37℃、5%CO2培养箱内培养。1.2利用免疫荧光技术检测细胞ck-18和villin的表达鉴定肾小管上皮细胞的纯度。2.建立高糖刺激肾小管上皮细胞衰老模型高糖(30mmol/l)刺激第二代肾小管上皮细胞72h后(设等渗透压甘露醇对照组、正常糖浓度对照组)后,观察细胞形态及免疫荧光染色p16、dcr2和sa-β-gal观察细胞衰老情况。3.明确肾康注射液能否抑制高糖刺激后肾小管上皮细胞衰老实验分组:(1)正常对照组;(2)30mmol/l高糖组;(3)等渗透压甘露醇组;(4)30mmol/l高糖+50mg/l肾康注射液;(5)30mmol/l高糖+100mg/l肾康注射液;(6)30mmol/l高糖+200mg/l肾康注射液;(7)5mmol/l正常糖+200mg/l肾康注射液。肾康注射液和高糖培养肾小管细胞72h后,观察细胞形态及免疫荧光染色检测各组衰老指标:sahf、p16、cyclind1、dcr2和sa-β-gal表达情况。4.探明肾康注射液抑制高糖刺激后肾小管上皮细胞衰老的机制实验分组:(1)正常对照组;(2)30mmol/l高糖组;(3)等渗透压甘露醇组;(4)30mmol/l高糖+200mg/l肾康注射液;(5)5mmol/l正常糖+200mg/l肾康注射液;肾康注射液和高糖培养肾小管细胞72h后,利用试剂盒检测各组mda含量和sod活性。利用pcr、westernblot检测各组klotho、sirt1、ppar-γ、p66shc以及mtor的表达水平。5.统计学分析采用spss18.0统计软件分析,计量资料以均数±标准差(x?±s)表示,对于符合正态分布的组间比较进行单因素方差分析(anova),结果以p0.05为相差显著。结果1.高糖组肾小管上皮细胞明显扁平肥大,衰老标志p16ink4,sahf,cyclind1,dcr2和sa-β-gal明显上调,甘露醇作为等渗对照组并未引起肾小管上皮细胞衰老。而肾康注射液可以显著下调衰老标志p16ink4,sahf,cyclind1,dcr2和sa-β-gal的表达,使细胞形态趋于正常,具有良好的量效关系。肾康注射液可以显著缓解高糖诱导肾小管上皮细胞衰老指标的表达,说明肾康注射液可以抑制高糖诱导后肾小管上皮细胞的衰老,呈现良好的剂量依耐性。2.高糖组肾小管细胞mda含量明显上调而sod活力明显下降,而肾康注射液可以显著下调mda含量明显上调sod活力,提示肾康注射液具有抗氧化应激的作用。3.高糖组肾小管细胞mtor和p66shc促衰老分子表达上调,klotho,sirt1,ppar-γ抗衰老分子表达下调,而肾康注射液可以显著下调mtor和p66shc促衰老分子,显著增加Klotho,Sirt1,PPAR-γ抗衰老分子表达。肾康注射液通过抑制p66Shc、mTOR的表达,上调Klotho、Sirt1、PPAR-γ的表达抑制高糖诱导肾小管上皮细胞的衰老。结论本研究证明了肾康注射液具有抑制高糖诱导肾小管上皮细胞应激性衰老的作用,这一作用可能与抗氧化应激,抑制p66Shc、m TOR的表达,上调Klotho、Sirt1、PPAR-γ的表达有关。肾康注射液防止高糖诱导的肾小管细胞应激性衰老的作用可作为用于糖尿病肾病治疗的新策略。
【关键词】：肾康注射液 应激性衰老 肾小管上皮细胞 糖尿病肾病
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R692.9
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 1 前言13-15
• 2 研究方法15-21
• 3 结果21-28
• 4 讨论28-30
• 全文结论30-31
• 参考文献31-35
• 文献综述 中药在慢性肾脏病细胞应激性衰老中的研究进展35-46
• 参考文献41-46
• 研究生期间撰写和发表的论文46-47
• 致谢47

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