STAT3信号通路在肾母细胞瘤肿瘤干细胞发生发展及凋亡中的作用

发布时间：2017-06-08 22:01

  本文关键词：STAT3信号通路在肾母细胞瘤肿瘤干细胞发生发展及凋亡中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:通过对肿瘤标志物AKT、GSK-3β、Snail在肾母细胞瘤组织中的免疫组化研究及STAT3对肾母细胞瘤肿瘤干细胞增殖,凋亡作用的研究,探讨AKT、GSK-3β及Snail与肾母细胞瘤分级,预后等各临床指征间的相关性,以及STAT3抑制后对肾母细胞瘤G401细胞株肿瘤干细胞增殖、凋亡等的影响作用,旨在为肾母细胞瘤肿瘤治疗的基础研究提供一定的理论依据及实验基础。方法:本研究分为三部分。第一部分通过对肾母细胞瘤组织切片进行AKT、GSK-3β、Snail免疫组化染色,分析三种肿瘤标志物与肾母细胞瘤各临床指征间的相关性;第二部分通过免疫磁珠分选法自肾母细胞瘤G401细胞株中分选并获得CD133+细胞群,并通过细胞球形成实验,平板克隆实验,划痕实验,RT-PCR实验及裸鼠体内成瘤实验证明CD133+细胞具有肿瘤干细胞性质;第三部分使用STAT3抑制剂Stattic作用于G401细胞株中的CD133+细胞,MTT法检测在不同给药浓度(0μM,0.625μM,1.25μM,2.5μM,5μM)Stattic作用下对CD133+细胞增殖抑制作用,Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染检测Stattic对CD133+细胞凋亡的影响,裸鼠体内实验检测Stattic对CD133+细胞所成瘤体的抑制作用。WesternBlot实验检测Stattic对CD133+细胞凋亡相关蛋白Bcl-2及Bcl-xl的影响。结果:1.AKT、GSK-3β、Snail在肾母细胞瘤组织中免疫组化染色结果:AKT的表达水平与肾母细胞瘤的临床分期和转移两指标间具有显著相关性(p=0.029,p=0.005);而Snail的表达水平则与肾母细胞瘤的临床分期,转移及复发三指标间具有显著相关性(p=0.007,p=0.001,p=0.042),然而,GSK-3β与肾母细胞瘤各临床指征间并无显著相关(p0.05);Akt与Snail的表达水平间具有相关性(p=0.039),而Akt与Snail均与GSK-3β的表达无显著相关(p0.05);AKT、Snail表达水平高的肾母细胞瘤患儿,其无病生存期(Disease Free Survival,DFS)、总生存期(Overall Survival,OS)显著降低(p0.05);而GSK-3β与肾母细胞瘤患儿的无病生存期及总生存期间并无显著相关(p0.05)。2.免疫磁珠分选结果:分选前经流式细胞仪检测G401细胞株中CD133+细胞比例为7.38%,经免疫磁珠分选后检测分选所得细胞中CD133+细胞的表达水平,结果显示,其中CD133+肾母细胞瘤细胞的比例高达99.97%。3.细胞球形成实验结果:CD133+肿瘤细胞较CD133-细胞及亲代肿瘤细胞具有更强的细胞球形成能力(p0.05)。4.平板克隆形成实验结果:CD133+细胞组形成的克隆数目显著高于CD133-细胞组及亲代细胞组(p0.05)。5.划痕实验结果:CD133+细胞较CD133-细胞具有更强的迁移能力。6.RT-PCR实验结果:CD133+细胞中肿瘤干细胞相关基因SOX、NANOG、OCT4的表达水平均较CD133-组及亲代细胞组更高(p0.05)。7.裸鼠体内成瘤实验结果:注射CD133+细胞组裸鼠的肿瘤形成率及肿瘤大小均高于注射CD133-细胞组裸鼠。8.MTT法检测结果:肾母细胞瘤CD133+细胞的存活率随着Stattic药物浓度(0-5μM)的逐渐增加,其存活率逐渐降低。在0.625μM和1.25μM的Stattic药物浓度下,其对细胞的抑制率分别为25%及46%。9.Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染检测结果:经Stattic处理后,CD133+细胞凋亡水平明显升高,且与Stattic存在浓度依赖性,随着Stattic浓度的增加,CD133+细胞的凋亡数目增高。10.裸鼠体内实验结果:通过腹腔给药,Stattic能够有效抑制CD133+细胞所成瘤体的生长,给药第四周,CD133+/Stattic组裸鼠所成瘤体的体积显著小于CD133+对照组(p0.05)。瘤体的HE染色结果显示CD133+/Stattic组较对照组发生明显的细胞凋亡现象,包括染色质浓缩,核固缩,细胞结构消失等。而对照组细胞核深染,核分裂象较多,表明细胞仍在较为活跃的增殖状态。11.WesternBlot实验结果:经Stattic处理后p-STAT3的表达明显降低,而经Stattic处理后凋亡相关蛋白Bcl-2,Bcl-xl的蛋白表达水平也随之下降。结论:1.AKT的表达水平与肾母细胞瘤患儿的临床分期和转移两指标间具有显著相关性;而Snail的表达水平则与肾母细胞瘤的临床分期,转移及复发三指标间具有显著相关性;AKT与Snail的表达水平与肾母细胞瘤患儿的不良预后具有显著相关。而GSK-3β的表达水平则与肾母细胞瘤各临床指征间无显著相关。2.肾母细胞瘤中CD133+细胞具有肿瘤干细胞性质,提示着CD133可能为肾母细胞瘤的肿瘤干细胞标志物。3.通过靶向抑制其中的STAT3,可有效抑制肾母细胞瘤CD133+细胞的生长,加速其凋亡。
【关键词】：肾母细胞瘤 AKT GSK-3β Snail CD133 肿瘤干细胞
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.11
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 缩略词8-12
• 前言12-15
• 第一部分 p-AKT, GSK-3β 及Snail与肾母细胞瘤的发生发展及预后间的相关性研究15-24
• 1 材料与方法15-17
• 1.1 实验仪器15
• 1.2 实验试剂15
• 1.3 肾母细胞瘤组织切片15-16
• 1.4 实验方法16-17
• 1.4.1 收集肾母细胞瘤临床病理组织及切片16
• 1.4.2 肾母细胞瘤肿瘤组织免疫组织化学染色分析16
• 1.4.3 肾母细胞瘤临床病理指标评判16
• 1.4.4 统计学方法16-17
• 2 结果17-22
• 2.1 收集肾母细胞瘤组织切片，，探究各肿瘤标志物与肾母细胞瘤临床病理指标间的相关性17
• 2.2 各肿瘤标志物间的相关性17
• 2.3 各肿瘤标志物与肾母细胞瘤患者不良预后间的相关性17-22
• 3 讨论22-24
• 第二部分 肾母细胞瘤肿瘤干细胞的分选与鉴定24-37
• 1 材料与方法24-28
• 1.1 实验仪器24
• 1.2 实验试剂24-25
• 1.3 实验细胞25
• 1.4 实验动物25
• 1.5 常用溶液的配置25
• 1.6 免疫磁珠分选装置25-26
• 1.7 实验方法26-28
• 1.7.1 肾母细胞瘤细胞株细胞（G401）培养26
• 1.7.2 肾母细胞瘤干细胞分选前流式细胞仪检测26
• 1.7.3 肾母细胞瘤干细胞免疫磁珠分选26-27
• 1.7.4 肾母细胞瘤干细胞分选后流式细胞仪检测27
• 1.7.5 肾母细胞瘤干细胞的体外鉴定27-28
• 1.7.6 肾母细胞瘤干细胞的体内鉴定28
• 2 结果28-35
• 2.1 流式细胞仪检测肾母细胞瘤细胞系中肿瘤干细胞标志物的表达28-30
• 2.2 CD133+肾母细胞瘤细胞具有更强的成球能力30
• 2.3 CD133+肾母细胞瘤细胞具有更强的克隆形成能力30-31
• 2.4 CD133+肾母细胞瘤细胞具有更强的侵袭转移能力31-33
• 2.5 CD133+肾母细胞瘤细胞肿瘤干细胞相关基因表达水平更高33-34
• 2.6 CD133+细胞在裸鼠体内的致瘤性34-35
• 3 讨论35-37
• 第三部分 STAT3对肾母细胞瘤肿瘤干细胞特性及凋亡的影响37-44
• 1 材料与方法37-40
• 1.1 实验仪器37
• 1.2 实验试剂37-38
• 1.3 常用溶液的配置38
• 1.4 实验方法38-40
• 1.4.1 MTT实验38
• 1.4.2 Annexin V凋亡检测38-39
• 1.4.3 Western Blot检测凋亡相关蛋白39
• 1.4.4 体内实验观察抑制STAT3对肾母细胞瘤干细胞成瘤能力的影响39
• 1.4.5 裸鼠瘤体HE染色39-40
• 2 结果40-43
• 2.1 MTT法检测Stattic有效抑制浓度40
• 2.2 Annexin-V-FITC/PI双染检测Stattic促进了CD133+细胞的凋亡40-41
• 2.3 Stattic有效抑制CD133+细胞所成瘤体的生长41-42
• 2.4 肾母细胞瘤肿瘤组织HE染色情况42
• 2.5 WesternBlot法检测STAT抑制剂能够有效抑制STAT3磷酸化，并促进了肾母细胞瘤CD133+细胞的凋亡42-43
• 3 讨论43-44
• 全文总结44-46
• 参考文献46-52
• 在学期间的研究成果52-53
• 致谢53

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 Xiu-Fen Zheng;Yue-Dong Sun;Xue-Yan Liu;;Correlation of expression of STAT3,VEGF and differentiation of Th17cells in psoriasis vulgaris of guinea pig[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2014年04期

2 张华;李苏宜;;CD133与肿瘤干细胞研究进展[J];癌症;2010年03期

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本文编号：433792