酸性环境对慢性肾衰竭大鼠血管钙化的影响及机制研究

发布时间：2017-06-10 13:10

  本文关键词：酸性环境对慢性肾衰竭大鼠血管钙化的影响及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:流行病学研究发现,慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease,CKD)发病率逐年升高,目前成为了世界性难题,研究显示心血管疾病(Cardiovascular Disease,CVD)成为CKD患者首位死因,而血管钙化是心血管疾病发生的独立危险因素。血管中膜钙化是CKD患者血管钙化的主要特征。血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)作为血管中膜的重要组成成分,研究发现,酸性环境可以抑制血管中膜钙化,但其具体机制尚不明确。本研究探讨酸性环境对慢性肾衰竭大鼠血管钙化的影响及可能机制。方法:1实验分组和模型构建1.1以行5/6肾切除术来构建大鼠慢性肾衰竭的模型,再通过饲喂骨化三醇引起大鼠血管钙化的发生,饲喂NH4CL构建大鼠的慢性代谢性酸中毒的模型。将22只健康雄性SD大鼠,将大鼠随机分成4组,即假手术组(sham;n=6)、慢性肾衰竭组(CKD;n=5)、钙化组(CKD+VC;n=5)和酸干预组(CKD+VC+AC;n=6)。于大鼠的腹主动脉穿刺采血,血气分析测定动脉血pH,动脉血用肝素抗凝,离心后,分离血浆,-80℃冻存备用。取大鼠胸腹主动脉全长,用于组织学观察和钙含量测定。1.2体外细胞实验用10m Mβ-甘油磷酸诱导VSMCs钙化,依据动物实验大鼠血气分析结果,酸干预大鼠动脉血气pH值为7.143±0.163,体外实验为更好模拟体内实验,选定酸干预组pH值为7.1。将VSMCs随机分为4组:(1)正常+pH7.4组(2)高磷+pH7.1组(3)高磷+pH7.4组(4)维拉帕米干预组。2大鼠标本采集与处理5周之后用2%戊巴比妥钠30mg/kg予大鼠麻醉,腹主动脉穿刺,应用血气分析仪检测动脉pH、[HCO~(3-)]浓度,同时采血用Unicel Dxc800全自动生化分析仪检测大鼠血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。摘取胸主动脉全段:上段组织保存于液氮用于钙含量检测;下段用10%甲醛固定后石蜡包埋行钙化染色及runx2和LTCCβ3亚基免疫组织化学染色。血管von Kossa钙化染色检测血管钙化情况,钙盐沉积处被染为黑色。血管钙含量测定:邻甲酚酞络合酮比色法测定钙含量,以mg/g为单位。免疫组织化学法检测血管runx2和LTCCβ3表达3各组VSMCs目的基因的表达提取细胞干预4天后正常+pH7.4组、高磷+pH7.1组、高磷+pH7.4组、维拉帕米干预组m RNA,测定L型钙通道(calcium channels,L-type,LTCC)β3亚基和runx2基因的表达。4各组VSMCs目的蛋白的表达Western印迹:L型钙通道(calcium channels,L-type,LTCC)β3亚基和runx2蛋白的表达。5 VSMCs钙化情况及ALP的活性测定细胞钙含量测定:细胞培养14天后弃去上清,BCA法测定细胞蛋白含量,结果用蛋白含量标准化钙含量(mg/g蛋白)。茜素红钙化染色:茜素红(0.1%,pH8.3)染液中37℃温箱赋育30min,结果判断标准:钙盐沉积为橘红色。ALP活性测定:依据ALP活性试剂盒测定ALP活性,结果用蛋白质校准ALP活性。6血管平滑肌细胞内钙离子浓度测定在细胞刺激4天,采用钙离子探针检测VSMCs内钙离子浓度。结果:1体外酸性环境对高磷诱导的VSMCs钙化的影响细胞培养14天后,钙含量结果与钙化茜素红染色一致,与正常+pH7.4组相比,高磷+pH7.4组钙含量明显增多(P0.05),钙盐沉积较多;与高磷+pH7.4组相比,高磷+pH7.1组细胞钙含量明显减少(P0.05),橘红色钙盐沉积较少。2体外酸性环境对高磷诱导的VSMCs LTCCβ3亚基的表达和细胞外钙离子内流效应的影响RT-PCR和western印记结果显示,高磷+pH7.4组LTCCβ3亚基m RNA表达和蛋白水平较正常+pH7.4组增加(P0.05);但是高磷+pH7.1组的表达量明显较高磷+pH7.4组表达减少(P0.05)。血管平滑肌细胞Fluo-3/AM荧光强度和荧光显色结果显示,与正常+pH7.4组相比,高磷+pH7.4组血管平滑肌细胞荧光强度增加(P0.05);与高磷+pH7.4组相比,高磷+pH7.1组胞内的荧光强度下降(P0.05)。3体外酸性环境对高磷诱导的大鼠VSMCs runx2表达和ALP活性的影响RT-PCR和western印记结果显示保持一致,同正常+pH7.4组相比,高磷+pH7.4组runx2表达水平增加(P0.05);与高磷+pH7.4组相比,高磷+pH7.1组表达量明显减少(P0.05)。ALP活性测定结果显示:酸性环境抑制了ALP活性(P0.05)。维拉帕米阻断LTCC后,减少细胞内钙离子荧光强度(P0.05),抑制高磷诱导的runx2表达(P0.05),减少钙盐沉积(P0.05)。4酸性环境对慢性肾衰竭大鼠主动脉钙化情况比较与假手术组(n=6)大鼠相比,慢性肾衰竭组(n=5)、钙化组(n=5)及酸干预组(n=6)大鼠血肌酐和尿素氮水平均显著增高(P0.05);与假手术组、慢性肾衰竭组(n=5)、钙化组(n=5)分别比较,酸干预组大鼠动脉血pH和[HCO3-]水平均下降(P0.05)。钙含量结果显示,与假手术组相比较,慢性肾衰竭组大鼠主动脉钙含量无明显增高(2.33±0.42vs2.41±0.41,P0.05),钙化组大鼠主动脉钙含量显著增高(9.66±1.62vs2.41±0.41,P0.05);与钙化组相比,酸干预大鼠主动脉钙含量明显降低(4.83±0.73vs9.66±1.62,P0.05)。von Kossa染色结果保持一致。5体内酸性环境对慢性肾衰竭大鼠LTCCβ3亚基和runx2在主动脉的表达的影响免疫组织化学结果显示,假手术组和慢性肾衰竭组runx2和LTCCβ3亚基免疫组化评分均低于钙化组(6.20±1.64vs2.16±0.75,6.20±1.64vs3.00±1.00,6.60±2.51vs1.83±0.98,6.60±2.51vs2.60±0.55),差异有统计学意义(P0.05);大鼠体内酸性环境下调runx2和LTCCβ3亚基的表达(6.20±1.64vs3.83±1.33,6.60±2.51vs3.00±1.45,P0.05)。结论:酸性环境可以抑制VSMCs的钙化,其机制可能是酸性环境通过下调L型钙通道β3亚基表达,阻滞钙离子内流,来起到抗VSMCs成骨成软骨样表型转化的作用。
【关键词】：血管平滑肌细胞 β-甘油磷酸盐 酸性环境 钙化 runx2 LTCCβ3亚基 慢性肾衰竭
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692.5
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文缩写13-14
• 前言14-15
• 材料与方法15-23
• 结果23-25
• 附图25-28
• 附表28-29
• 讨论29-32
• 结论32-33
• 参考文献33-35
• 综述 钙信号通路对血管钙化影响的研究进展35-42
• 参考文献40-42
• 致谢42-43
• 个人简历43

【参考文献】

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1 白亚玲;徐金升;钱sネ，

本文编号：438589