白藜芦醇对肾癌细胞的影响及机制研究

发布时间：2017-06-13 06:02

  本文关键词：白藜芦醇对肾癌细胞的影响及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的检测NLRP3在肾癌组织和相应的正常肾组织中的蛋白表达水平,探讨白藜芦醇(RSV)对肾癌786-O细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用以及NLRP3炎症小体信号通路和去乙酰化酶Sirt1在此过程中的作用。方法1.Western blot方法检测肾癌组织和癌旁正常组织中NLRP3的蛋白表达水平。2.将786-O细胞随机分为CON对照组、RSV处理组,将RSV处理组分别用25μM、50μM、100μM RSV处理12h、24h、48h,用CCK-8的方法检测RSV处理后786-O细胞的增殖情况;倒置显微镜下观察经过50μM RSV处理后,786-O肾癌细胞在形态学上的改变;细胞划痕实验检测50μM RSV对786-O肾癌细胞的迁移能力的影响;Transwell体外侵袭实验检测50μM RSV对786-O肾癌细胞的侵袭能力的影响;AnnexinV/PI双染法检测50μM RSV对786-O肾癌细胞凋亡情况的影响;Western blot检测50μM RSV作用于786-O肾癌细胞12h、24h、48h后凋亡相关蛋白Bax的表达情况。3.将肾癌786-O细胞随机分为CON对照组、LPS+ATP处理组、LPS+ATP+RSV处理组(RSV处理组),除CON对照组之外,另两组均用LPS处理786-O细胞5.5h,随后加入ATP处理0.5h,RSV处理组于LPS加入前使用50μM RSV预处理肾癌786-O细胞0.5h,且全程含有RSV。利用Real-time PCR的方法检测LPS处理后各组786-O细胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、Sirt1的RNA表达水平。同时,用小干扰RNA沉默RSV处理组786-O细胞中Sirt1基因,检测沉默Sirt1基因以后后786-O细胞中NLRP3、Sirt1的RNA表达情况。结果1.与对照组相比,25μM、50μM、100μM RSV处理786-O细胞12h、24h、48h后,细胞的增殖能力均显著下降,其中25μM RSV处理12h、24h、48h后的细胞增殖的抑制率分别为10.22±4.02%、23.81±5.19%、31.45±6.15%,50μM RSV处理12h、24h、48h后的细胞增殖的抑制率分别为19.05±4.89%、44.85±3.38%、52.54±6.55%,100μM RSV处理12h、24h、48h后的细胞增殖的抑制率分别为27.47±4.84%、53.55±13.03%、67.02±10.78%。根据IC50最终选择50μM RSV作为后续实验的药物浓度。50μM RSV处理后,在倒置显微镜下可以观察到786-O细胞的细胞核浓集,细胞形状由长梭形或者不规则形变为小圆形,细胞边缘由清晰变模糊,生长状态变差。与对照组相比,相同时间内50μM RSV处理组细胞迁移的距离显著小于对照组细胞迁移的距离;50μM RSV处理后,通过基质胶到达微孔膜底层的细胞数目明显减少,与对照组的39.23±3.64相比,RSV处理后微孔膜底层的细胞数目仅为11.21±4.19,两组之间的差异具有统计学意义(P0.05);50μM RSV处理后786-O细胞凋亡的程度显著增加,对照组细胞凋亡率(UR象限+LR象限)较低,为3.56%,其中早期凋亡率2.08%,晚期凋亡率1.46%,RSV处理组细胞凋亡率(UR象限+LR象限)明显升高,可达15.27%,其中早期凋亡率3.74%,晚期凋亡率11.53%;50μM RSV处理12h、24h、48h后凋亡相关蛋白Bax的蛋白表达水平与对照组相比升高,并且随着处理时间的延长786-O细胞内的Bax的蛋白表达水平逐渐增加,其中处理48h的蛋白表达量升高最明显。2.与癌旁正常组织相比,肾癌组织中的NLRP3蛋白表达水平明显增高(P0.05)。体外实验中与对照组相比,LPS+ATP处理组NLRP3、Caspase-1、IL-1β的mRNA表达水平显著升高,用RSV预处理后,NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达均被抑制,且与LPS+ATP处理组相比差异具有统计学意义(P0.05),此外Sirt1的蛋白表达水平升高(P0.01);同时凋亡相关蛋白Bax的表达水平升高,说明786-O细胞凋亡增加;沉默Sirt1基因后,RSV降低786-O细胞内NLRP3的作用消失,与RSV处理组相比,差异具有统计学意义(P0.05),同时Bax的表达水平与RSV处理组相比显著下降,说明沉默Sirt1对癌细胞具有保护作用。结论综上所述,RSV处理后肾癌786-O细胞的增殖、迁移和侵袭能力受到明显抑制,癌细胞的凋亡增加。在RSV促凋亡的过程中,NLRP3炎症小体信号通路及其下游分子起重要作用,同时,去乙酰化酶Sirt1参与了NLRP3炎症小体的活化过程,NLRP3和Sirt1在RSV促进癌细胞凋亡过程中的作用值得进一步探讨。
【关键词】：白藜芦醇 肾癌 炎症 NLRP3 Sirt1
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.11
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-17
• 研究现状、成果11-15
• 研究目的、方法15-17
• 一、白藜芦醇对肾癌 786-O细胞的影响17-34
• 1.1 对象和方法17-26
• 1.1.1 细胞系17
• 1.1.2 常规试剂和耗材17-18
• 1.1.3 实验用抗体18
• 1.1.4 实验所需主要试剂以及主要溶液的配制18-21
• 1.1.5 主要仪器设备21
• 1.1.6 实验方法21-26
• 1.2 结果26-31
• 1.2.1 CCK-8 法检测RSV对 786-O细胞增殖的影响26-27
• 1.2.2 白藜芦醇对 786-O细胞形态学的影响27-28
• 1.2.3 细胞划痕实验检测白藜芦醇对 786-O细胞迁移能力的影响28-29
• 1.2.4 Transwell实验检测白藜芦醇对 786-O细胞侵袭能力的影响29-30
• 1.2.5 流式细胞术检测白藜芦醇对 786-O细胞凋亡的影响30
• 1.2.6 白藜芦醇对 786-O细胞凋亡相关蛋白Bax表达的影响30-31
• 1.3 讨论31-33
• 1.4 小结33-34
• 二、白藜芦醇对肾癌 786-O细胞作用机制的探讨34-50
• 2.1 对象和方法34-41
• 2.1.1 组织以及细胞系34
• 2.1.2 常规试剂和耗材34-35
• 2.1.3 实验用抗体35
• 2.1.4 实验所需主要试剂以及主要溶液的配制35-38
• 2.1.5 主要仪器设备38
• 2.1.6 实验方法38-41
• 2.2 结果41-46
• 2.2.1 肾癌组织与癌旁正常组织中NLRP3的蛋白表达水平41-42
• 2.2.2 LPS和ATP共处理 786-O细胞引发炎症模型42-43
• 2.2.3 白藜芦醇对 786-O细胞炎症模型中相关分子表达水平的影响43-44
• 2.2.4 白藜芦醇对 786-O细胞炎症模型Sirt1蛋白表达水平的影响44
• 2.2.5 沉默Sirt1基因后白藜芦醇对 786-O炎症模型NLRP3蛋白表达水平的影响44-46
• 2.3 讨论46-49
• 2.4 小结49-50
• 结论50-51
• 参考文献51-59
• 发表论文和参加科研情况说明59-60
• 综述 NLRP3炎症小体与肿瘤发生关系的研究进展60-67
• 综述参考文献63-67
• 致谢67-68
• 个人简历68

  本文关键词：白藜芦醇对肾癌细胞的影响及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：445820