膀胱癌患者尿液中外泌体及相关miRNAs的检测及临床意义

发布时间：2017-06-19 13:19

  本文关键词：膀胱癌患者尿液中外泌体及相关miRNAs的检测及临床意义，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的探讨差速超速离心法从膀胱癌患者尿液中提取外泌体(exosome)及相关微小RNAs(microRNAs,miRNAs)的可行性。对exosome及miRNAs进行鉴定,分析其潜在的临床价值,为进一步在尿液中寻找膀胱癌诊断标记物做前期准备。方法一、Exosome的差速超速离心提取1.1尿液标本的获取。检索病例资料数据库,统计分析既往我院膀胱癌入院患者的数量及分布情况,说明该实验标本易得。选择可行的留取膀胱癌患者合格尿液标本的方案,制定留取策略,留取标本。1.2差速超速离心。划分非肉眼血尿和肉眼血尿两个实验组。在留取的100ml尿液中加入保护剂。4℃下进行离心操作。提前预冷离心机和转子。2000 g离心10分钟后去除大的细胞碎片;再17000 g离心45分钟,去除较小的碎片和较大的细胞外囊泡;然后200000 g离心70分钟,去除上清液;加入PBS重悬再次离心;最后用40μl去离子水溶解,-80℃冻存,或继续下一步实验。二、Exosome的鉴定分析2.1透射电子显微镜观察。取上步中离心提取的样品10μl,加入去离子水稀释后在超声振荡仪下将exosome分散开,取10μl稀释分散后的样品滴加在超薄碳膜铜网的碳膜面,1分钟后滤纸从铜网一侧吸去多余的样品,再滴加5μl多聚甲醛固定液,10分钟后吸去多余液体;然后滴加5μl PBS溶液,5分钟,重复三遍;再滴加5μl戊二醛固定液,10分钟后吸去多余液体;PBS溶液清洗三遍;最后滴加5μl磷钨酸染液。1分钟后,白炽灯下烤干后镜下观察。2.2纳米微粒追踪分析(NTA)。开机,设置参数;取3μl离心提取物,加入约0.3 ml水中混匀;将混匀的液体注入,开始分析。2.3免疫印迹实验。BCA法测定提取的exosome中蛋白浓度。配制所需试剂。将标本在95℃下加热5分钟变性。然后上样后进行120 V恒压下电泳。然后350 mA恒流下电转70分钟。将PVDF膜在5%封闭液中4℃摇晃过夜封闭。然后一抗室温孵育2小时,二抗室温孵育1小时。显影观察目的蛋白的表达情况。三、miRNA的鉴定分析3.1 miRNA的提取。应用miRNA提取试剂盒提取exosome中的miRNA,并测量其浓度。冷冻真空干燥法纯化mi RNA。3.2 qPCR分析。设置qPCR参数:解链温度94℃,时间2分钟;变性温度为94℃,时间20秒;退火温度设置为62℃,时间34秒。循环43次。结果1、本院膀胱癌入院患者数量较多,签订知情同意书可提高留取合格尿液标本的成功率,为23/25。2、差速超速离心法可稳定的从膀胱癌患者尿液中提取外泌体。3、电镜、NTA和免疫印迹结果显示离心提取物中大量外泌体的存在,同时发现其中混杂有胞外囊泡。4、通过qPCR检测到健康人尿液和膀胱癌患者尿液中15b-5p等miRNA具有显著性的差异。结论1、本研究获取大量尿液标本的可行性高。2、膀胱癌患者尿液离心提取物中含有大量exosome。3、可以从exosome中提取出miRNA。4、通过差速超速离心法提取膀胱癌患者尿液中exosome及mi RNA可行、可靠。尿液将成为膀胱癌诊断生物标记物的良好来源。
【关键词】：膀胱癌 尿液 外泌体 微小RNA 鉴定分析
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.14
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语/符号说明11-14
• 前言14-17
• 研究现状、成果14-15
• 研究目的、方法15-17
• 一、膀胱癌患者尿液中exosome的超速低温提取17-31
• 1.1 对象和方法17-24
• 1.1.1 主要实验试剂17-18
• 1.1.2 主要实验仪器18-19
• 1.1.3 主要实验试剂的配制19-20
• 1.1.4 尿液的留取和保存20-22
• 1.1.5 差速超速离心法提取尿液中exosome22-23
• 1.1.6 统计学分析方法23-24
• 1.2 结果24-26
• 1.2.1 本研究平台膀胱癌患者尿液标本容易获得24
• 1.2.2 通过制定患者知情同意书提高留取合格标本的成功率24-25
• 1.2.3 非肉眼血尿组和肉眼血尿组尿液离心效果比较25-26
• 1.3 讨论26-30
• 1.4 小结30-31
• 二、Exosome的鉴定分析31-47
• 2.1 对象和方法31-38
• 2.1.1 主要实验试剂31-32
• 2.1.2 主要实验仪器32-33
• 2.1.3 主要实验试剂的配制33-35
• 2.1.4 Exosome的透射电镜观察35-36
• 2.1.5 NTA技术检测exosome36
• 2.1.6 Exosome特征性蛋白质的提取和免疫印迹检测36-38
• 2.1.7 统计分析38
• 2.2 结果38-41
• 2.2.1 膀胱癌患者尿液中exosome的电镜鉴定38-39
• 2.2.2 膀胱癌患者尿液中exosome的NTA39-40
• 2.2.3 膀胱癌患者尿液中exosome标记蛋白的免疫印迹检测40-41
• 2.3 讨论41-45
• 2.4 小结45-47
• 三、Exosome中miRNA的相关分析47-63
• 3.1 对象和方法47-53
• 3.1.1 主要实验试剂47-48
• 3.1.2 主要实验仪器48-49
• 3.1.3 主要实验试剂的配制49-50
• 3.1.4 Exosome中miRNA的提取50
• 3.1.5 miRNA浓度的测定50
• 3.1.6 miRNA的纯化和浓缩（冷冻真空干燥法）50-51
• 3.1.7 miRNA反转录为cDNA51
• 3.1.8 普通PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳51-52
• 3.1.9 实时定量PCR(qPCR)扩增和琼脂糖凝胶电泳52-53
• 3.1.10 统计分析53
• 3.2 结果53-57
• 3.2.1 不同尿液中提取miRNA53-54
• 3.2.2 冷冻真空法纯化和浓缩miRNA54-55
• 3.2.3 qPCR实验结果55-57
• 3.3 讨论57-61
• 3.4 小结61-63
• 结论63-64
• 论文创新点64-65
• 参考文献65-72
• 发表论文和参加科研情况说明72-73
• 综述 尿液exosome及相关microRNA在膀胱癌诊断中的意义73-87
• 综述参考文献80-87
• 致谢87-88
• 个人简历88

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