前列腺癌特异性双功能MR分子探针的构建及其体外活性鉴定的实验研究

发布时间：2017-06-19 21:14

  本文关键词：前列腺癌特异性双功能MR分子探针的构建及其体外活性鉴定的实验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:1.培养人前列腺癌细胞系PC-3和LNCAP,并分别检测两种细胞表面HER2抗原的表达情况;2.构建p QE30-t BID重组表达载体,表达并纯化目的蛋白t BID;3.构建前列腺癌特异性双功能MR分子探针t BID-Gold Mag-Anti HER2,分别检测探针与两种前列腺癌细胞结合的特异性及其对前列腺癌细胞靶向杀伤的能力,并评估其MR特异性成像的可行性。方法:1.常规培养人前列腺癌细胞系PC-3和LNCAP,在光镜下分别观察两种细胞的形态以及生长状况。用流式细胞术分别检测两种细胞表面HER2的表达情况。2.根据t BID的基因序列设计特异性上、下游引物,利用普通PCR技术扩增目的基因t BID,经过双酶切、连接以及转化构建重组表达载体p QE30-t BID,将其转化到表达载体BL21(DE3)中,加入IPTG进行诱导表达,行SDS-PAGE凝胶电泳观察蛋白t BID的表达情况,镍亲和层析柱纯化目的蛋白后用Western Blot鉴定分析。3.利用金磁纳米微粒中胶体金可以与蛋白质类物质相互黏附结合的特性,分别将抗HER2抗体和活性促凋亡蛋白t BID偶联在其表面,构建分子探针t BID-Gold Mag-Anti HER2。4.利用流式细胞术和扫描电镜分别验证分子探针t BID-Gold Mag-Anti HER2与两种前列腺癌细胞PC-3和LNCAP靶向结合的能力,并采用细胞凋亡检测试剂盒检测分子探针对两种前列腺癌细胞的靶向促凋亡作用。5.将两种前列腺癌细胞分别与分子探针t BID-Gold Mag-Anti HER2作用后行MRI扫描,观察各细胞的MRI信号,并分别测量其信号强度,用方差分析比较各组间的信号差异,P0.05差异有统计学意义,从而探讨该探针应用于HER2阳性的前列腺癌细胞MR成像的价值。结果:1.在光镜下观察人前列腺癌PC-3细胞呈卵圆形贴壁生长;LNCAP细胞呈梭形贴壁生长;PC-3细胞的生长速度明显快于LNCAP细胞。2.普通PCR技术扩增后得到分子大小约411 bp的目的基因片段,行菌液PCR鉴定以及重组质粒的酶切鉴定,表明重组质粒中已含有t BID的基因序列,重组表达载体p QE30-t BID构建成功。将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)后,对诱导和未诱导的大肠杆菌的裂解上清样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分析以及考马斯亮蓝染色分析,结果显示:与未诱导组相比,IPTG诱导后转化入p QE30-t BID的大肠杆菌在约15 k D处可见与预期分子量大小一致的蛋白条带出现。Western Blot鉴定证实该蛋白即为目的蛋白t BID。3.流式细胞术结果显示PC-3细胞HER2表达为阳性,而LNCAP细胞HER2表达为阴性。4.将抗HER2抗体与t BID蛋白分别与金磁纳米微粒偶联,构建分子探针t BID-Gold Mag-Anti HER2。流式细胞术和扫描电镜结果均表明该分子探针可与前列腺癌PC-3细胞特异性结合,而不能与LNCAP细胞结合。细胞凋亡实验检测结果显示探针可与PC-3细胞特异性结合,并使其发生早期凋亡,而不能与LNCAP细胞特异性结合,且对其无明显促凋亡作用。5.将前列腺癌PC-3细胞和LNCAP细胞分别与分子探针作用后行MRI扫描,T2WI显示PC-3细胞与分子探针作用组的信号强度明显减低,而其余各组的信号强度均无明显减低。PC-3细胞与分子探针作用组与其余各组之间的信号强度差异均有统计学意义,其余各组彼此之间的信号强度差异无统计学意义。结论:本课题以前列腺癌PC-3细胞表面特异性高表达的HER2为靶点,以抗HER2抗体为亲和组件,以活性促凋亡蛋白t BID为杀伤组件,以金磁纳米微粒为MR信号组件,成功构建双功能MR分子探针t BID-Gold Mag-Anti HER2。经体外细胞实验验证该探针可特异性靶向前列腺癌PC-3细胞并促使其凋亡。与探针靶向作用后行MRI扫描,PC-3细胞可在MR上特异性成像。由此,本课题研究构建的MR双功能分子探针有望为前列腺癌的特异性诊断与靶向性治疗的研究奠定实验基础。
【关键词】：前列腺癌 分子影像学 人表皮生长因子受体2 细胞凋亡 截短型BID 原核表达 金磁纳米微粒
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25;R445.2
【目录】：

• 缩略语表6-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-16
• 前言16-19
• 文献回顾19-33
• 实验一 前列腺癌细胞系的培养及其HER2的表达33-40
• 1 材料33-35
• 1.1 细胞系33
• 1.2 主要试剂33-34
• 1.3 主要仪器设备34
• 1.4 主要溶液的配制34-35
• 2 方法35-37
• 2.1 前列腺癌细胞系PC-3 及LNCAP的培养35-36
• 2.2 前列腺癌PC-3 细胞和LNCAP细胞HER2的表达36-37
• 3 结果37-38
• 3.1 前列腺癌细胞系PC-3 及LNCAP的培养与观察37
• 3.2 前列腺癌PC-3 细胞和LNCAP细胞HER2的表达情况37-38
• 4 讨论38-40
• 实验二 活性促凋亡蛋白tBID的表达和纯化40-53
• 1 材料40-43
• 1.1 菌种及质粒40
• 1.2 主要试剂40-41
• 1.3 主要仪器设备41-42
• 1.4 主要溶液的配制42-43
• 2 方法43-47
• 2.1 细菌感受态的制备43-44
• 2.2 引物的设计与合成44
• 2.3 目的基因tBID的PCR扩增44-45
• 2.4 pQE30-tBID重组质粒的构建45-46
• 2.5 目的蛋白tBID的诱导表达46-47
• 2.6 目的蛋白tBID的纯化47
• 3 结果47-51
• 3.1 目的基因tBID PCR扩增产物的鉴定47-48
• 3.2 pQE30-tBID重组质粒的构建48-50
• 3.3 目的蛋白tBID的诱导表达及纯化50-51
• 4 讨论51-53
• 实验三 tBID-GoldMag-Anti HER2分子探针的构建及其对前列腺癌细胞的靶向性杀伤和MR特异性成像53-65
• 1 材料53-55
• 1.1 细胞系53
• 1.2 主要试剂53-54
• 1.3 主要仪器设备54
• 1.4 主要溶液的配制54-55
• 2 方法55-59
• 2.1 tBID-GoldMag-Anti HER2分子探针的构建55-56
• 2.2 tBID-GoldMag-Anti HER2与前列腺癌细胞的特异性结合56-57
• 2.3 tBID-GoldMag-Anti HER2促前列腺癌细胞凋亡57-58
• 2.4 tBID-GoldMag-Anti HER2对前列腺癌细胞的特异性MR成像58-59
• 3 结果59-63
• 3.1 tBID-GoldMag-Anti HER2与前列腺癌细胞的特异性结合59-61
• 3.2 tBID-GoldMag-Anti HER2促前列腺癌细胞凋亡61-62
• 3.3 tBID-GoldMag-Anti HER2对前列腺癌细胞的特异性MR成像62-63
• 4 讨论63-65
• 小结65-66
• 参考文献66-78
• 个人简历和研究成果78-80
• 致谢80-81

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