叉头状转录因子O1对高糖诱导下小鼠足细胞线粒体自噬的影响及机制研究

发布时间：2017-06-20 07:16

  本文关键词：叉头状转录因子O1对高糖诱导下小鼠足细胞线粒体自噬的影响及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景糖尿病肾病(Diabetes nephropathy,DN)是一种糖尿病微血管并发症,并且已经成为糖尿病对生存率危害最大的并发症之一。DN是导致终末期肾脏疾病(end stage renal disease,ESRD)的首要独立病因。足细胞损伤在DN发病中被认为是引起蛋白尿和肾小球硬化的关键。蛋白尿的产生主要是由于肾小球滤过屏障(glomerular filtrating barrier,GFB)的完整性受到破坏,进而影响其选择透过蛋白的功能。足细胞(Podocyte)是体内一种高度分化的细胞,定位于肾小球基底膜外侧,其胞体可伸出较自身长度数倍的一级和次级足突,包绕肾小球,相邻足突之间的直径为30-40nm的间隙又被渗透性裂孔隔膜(silt diaphragm,SD)所填充。作为肾小球滤过屏障的最后一层结构,足细胞及SD的完整性对维持肾小球滤过功能具有重要作用。叉头状转录因子O1(Forkhead transcription factor,Fox O1)属于叉头状转录因子O亚家族,在调控细胞抗氧化应激、静止/进入细胞周期、凋亡、增殖、炎症反应、糖脂代谢及自噬等多种病理生理过程,也在糖尿病肾病的发生发展中扮演重要的角色。研究表明,在使用STZ模拟的的DN鼠肾脏皮质中,Fox O1的转录活性呈抑制状态。在真核细胞内,线粒体是有氧代谢活动发生的主要场所,因此也是细胞内活性氧(ROS)产生的主要部位。在正常生理状况下,细胞可通过包括线粒体自噬(mitophagy)在内的一系列途径清除受损或衰老线粒体,以维持细胞内ROS含量的稳定。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)诱导的激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)是细胞在氧化应激状态下诱导生成的一种促生存因子,是参与调节线粒体自噬的重要功能蛋白之一,在高糖培养下的足细胞中表达量下降。有研究表明,在心肌细胞中PINK1可以作为Fox O1下游基因,参与氧化应激刺激中细胞的生存调节。DN发生时,Fox O1的肾脏保护作用是否也与活化PINK1,继而调节线粒体自噬,减少ROS过度生成有关,目前尚需进一步研究提供证据。目的观察Fox O1对高糖环境下小鼠足细胞线粒体自噬和线粒体功能的影响及作用机制。方法构建含组成性激活突变型(Constitutively active,CA)和短发夹RNA(sh RNA)Fox O1编码序列的慢病毒载体(LV-CA-Fox01、LV-sh Fox O1)、PINK1短发夹RNA(LV-sh PINK1)及空慢病毒载体(LV-NC)。36只SPF级雄性KM小鼠,随机选取其中27只使用STZ诱导构建DN模型,9只作为正常对照组(NG组)。造模成功后,将成模鼠随机分为3组:糖尿病组(DM组),糖尿病CA-Fox O1转染组(CA组)和糖尿病空病毒转染组(NC组)。小鼠麻醉后,在解剖显微镜下右侧肾皮质点注射CA-Fox O1慢病毒载体及空慢病毒载体(LV-NC)10μl×3处。于病毒注射后12周末,尾静脉取血测血糖后麻醉小鼠,迅速剥离出肾脏,置于4%多聚甲醛中固定用于HE检查,于4%预冷戊二醛固定用于电子显微镜检查。新鲜肾脏于液氮中冷冻,q RT-PCR检测肾皮质中Fox O1m RNA水平,蛋白免疫印迹法检测各组肾皮质中Fox O1、p-Fox O1、PINK1、parkin、p62、MFN2蛋白表达。转染培养在正常糖浓度(5.6mmol/L)培养基中的条件永生性小鼠足细胞(Conditionally immortalized mouse podocyte cell line,CIMPs)。将细胞按不同培养环境及处理分为:(1)正糖对照组(NG,5.6mmol/L);(2)单纯高糖组(HG,25mmol/L);(3)Fox O1上调组(HG+LV-CA-Fox O1);(4)双转染组(HG+LV-CA-FOx O1+LV-sh RNA-PINK1);(5)HG+空慢病毒转染组(HG+LV-NC);(6)正常糖+Fox O1下调组(NG+LV-sh RNA-Fox O1)。各组处理72h后,q RT-PCR检测(1)-(3)及(6)组Fox O1m RNA表达水平,蛋白免疫印迹法检测(1)-(5)组PINK1、Parkin、MFN2、p62蛋白表达水平;细胞免疫荧光化学检测(1)-(3)及(6)组Fox O1蛋白分布情况;染色质免疫共沉淀(Ch IP)法检测Fox O1与PINK1启动子的结合情况;透射电镜观察(1)-(5)组线粒体及自噬体;激光共聚焦显微镜观察(1)-(5)组腺病毒载体介导的GFP-LC3与线粒体荧光探针共定位观测线粒体自噬水平;流式细胞仪结合DCFH-DA荧光探针法检测(1)-(5)组ROS的生成率,JC-1试剂盒测(1)-(5)组细胞线粒体膜电位。结果1.在DN模型鼠肾皮质中,慢病毒转染可上调Fox O1表达:与NC组相比,DM组Fox O1 m RNA表达变化无统计学意义(P0.05),而CA组Fox O1 m RNA水平较DM组明显上升(P0.05),p-Fox O1/Fox O1比值明显下降(P0.05)表示高糖可以诱导Fxo O1转录活性下降。2.上调Fox O1转录活性可以增加PINK1/parkin途径相关蛋白表达量,减缓小鼠DN进展:蛋白免疫印迹结果显示,CA组PINK1、parkin和MFN2蛋白表达量明显高于DM组(P0.05),p62蛋白相对表达量明显低于DM组(P0.05)。HE和扫描电镜染色显示CA组足突损失、足突融合等病变均较DM组有所减轻。3.转染CA-Fox O1可有效提高CIMPs中Fox O1表达水平:与(1)组相比,(2)组Fox O1m RNA水平无明显改变(P0.05),同(2)组相比,(3)组Fox O1m RNA相对表达量有所增加(P0.05)。同样,(6)组同(1)组相比,Fox O1m RNA水平明显下降(P0.05),说明转染sh-Fox O1可以显著降低Fox O1整体表达水平。4.染色质免疫共沉淀结果显示,在正常糖培养的CIMPs中,Fox O1可以同PINK1的启动子区域结合,高糖环境可以显著抑制这一行为(P0.05)。5.与(1)组相比,高糖明显降低足细胞中PINK1、Parkin、MFN2的蛋白表达水平(P0.05),升高p62的蛋白表达(P0.05);(3)组同(1)相比,转染CA-Fox O1可显著抑制高糖对上述指标的影响(P0.05);在(4)组中,CA-Fox O1的作用被PINK1sh RNA阻断(P0.05)。6.与(1)组相比,高糖处理和转染Fox O1-sh RNA均可明显减少足细胞核内Fox O1荧光强度(P0.05);(3)组同(1)相比,转染CA-Fox O1可显著抑制高糖的影响(P0.05);在(4)组中,CA-Fox O1的作用被PINK1sh RNA阻断(P0.05)。7.与(1)组相比,高糖可以明显降低足细胞内的线粒体膜电位(P0.05);(3)组同(1)相比,转染CA-Fox O1可显著提高线粒体膜电位(P0.05);在(4)组中,CA-Fox O1的作用被PINK1sh RNA阻断(P0.05)。8.与(1)组相比,高糖明显升高足细胞中ROS水平(P0.05);(3)组同(1)相比,转染CA-Fox O1可显著抑制高糖的影响(P0.05);在(4)组中,CA-Fox O1的作用被PINK1sh RNA阻断(P0.05)。9.透射电镜结果显示,与(1)组相比,高糖环境中的足细胞线粒体水肿、嵴断裂增加,粗面内质网脱颗粒现象严重。上调Fox O1后上述现象有所减轻,在此基础上下调PINK1后,不能观察到明显的损伤改善。10.激光共聚焦显微镜所拍摄照片显示,与(1)组相比,高糖环境下培养的足细胞红绿融合斑点数量减少(P0.05)。转染CA-Fox O1之后,融合斑点数量有所上升(P0.05),PINK1 sh RNA的转染可以阻断这一作用(P0.05)。结论1.肾皮质点注射CA-Fox O1病毒可以减缓糖尿病小鼠DN进展,激活PINK1/parkin途径。2.过表达FoxO1可以明显提高高糖状态下CIMPs线粒体自噬水平,降低高糖诱导的线粒体损伤,其机制可能是通过特异性结合PINK1基因启动子区域实现的。
【关键词】：FoxO1 足细胞 自噬 氧化应激 PINK1
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R692.9
【目录】：

• 摘要4-9
• Abstract9-15
• 中英文缩略词15-17
• 前言17-20
• 1 材料与方法20-38
• 2 结果38-41
• 3 讨论41-44
• 4 结论44-45
• 附图45-57
• 参考文献57-60
• 综述 叉头状转录因子FoxO和糖尿病肾病的关系60-74
• 参考文献68-74
• 个人简历74-75
• 在学期间发表的学术论文与研究成果75-76
• 致谢76

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