ROCK1介导慢性肾脏病引起的蛋白质能量消耗发病机制的研究

发布时间：2017-06-22 21:03

  本文关键词：ROCK1介导慢性肾脏病引起的蛋白质能量消耗发病机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:1、探讨慢性肾脏病激活ROCK1增加肌肉分解代谢促进肌肉萎缩的新机制。2、探究药物抑制ROCK1能否逆转慢性肾脏病所致的肌肉萎缩。方法:1、健康雄性8周龄C57BL6小鼠30只,体质量20~25g,分为4组:(1)正常对照组(CTL),(2)法舒地尔组(Fasudil,F),(3)慢性肾脏病组(chronic kidney disease,CKD),(4)慢性肾脏病+法舒地尔组(CKD+F);配对喂养野生型与基因敲除小鼠,8周龄,雄性,共24只,分为四组:(1)ROCK1~(+/+)假手术组,5只,(2)ROCK1~(-/-)假手术组,5只,(3)ROCK1~(+/+)CKD组,7只(4)ROCK1~(-/-)CKD组,7只。正常饲料适应性饲养2周后,CKD与CKD+F组,ROCK1~(+/+)CKD与ROCK1~(-/-)CKD组行肾脏5/6切除术,术后2周后予高蛋白饮食促进CKD模型成立。术后8周后测血肌酐、尿素氮。F组和CKD+F组予法舒地尔50mg/(kg·d)腹腔注射,持续6周。处死留取静脉血和肌肉。2、用含10%胎牛血清(FBS)和1%P-S的DMEM培育C2C12细胞,铺满六孔板面积约80%时换用含2%马血清(HS)的DMEM。至细胞分化成条状后,根据实验相应加入M-Fv-Casp3、AP20187及Fasudil(100μg/ml),分别处理48、24、24小时后刮取细胞留用。3、形态学观察:抗层黏蛋白免疫荧光染色:测肌肉横截面积及肌肉中ROCK1的表达;Western blot、免疫共沉淀、ELISA:检测PTEN、ROCK1、Rho A、PI3K、Akt的活性及p-MYPT、p-GSK3β、GAPDH的含量;RT-PCR:检测肌肉萎缩蛋白(Atrogin-1/MAFbx)和肌环脂蛋白(MuRF-1)mRNA的表达变化;同位素法:测趾长伸肌和比目鱼肌的蛋白降解率。4、所有计数结果用SPSS 19.0软件行数据统计分析。结果:1、CKD抑制PI3K的活性但Akt活性下降更为显著,且PTEN被激活:CKD时肌肉中的PI3K和Akt的活性均受抑制(P0.05,P0.01),但Akt活性的下降更为显著(P0.01)。PTEN的活性较对照组上升2.3倍(P0.05)。因此认为PTEN活性的升高是介导Akt活性下降的另一重要因素。2、ROCK1在CKD小鼠的骨骼肌中被激活:CKD小鼠的骨骼肌中ROCK1剪切片段升高,ROCK1活性升高2.6倍(P0.01),Rho A GTP酶的活性较对照组无显著差异。提示CKD小鼠的肌肉中ROCK1通过剪切被激活。3、ROCK1全身敲除可延缓CKD导致的肌肉萎缩:ROCK1~(+/+)假手术组与ROCK1~(-/-)假手术组小鼠的肌纤维横截面积分布率无显著差异,而ROCK1~(-/-)CKD组小鼠的肌纤维横截面积分布率相较于ROCK1~(+/+)CKD组显著右移。ROCK1~(+/+)假手术组与ROCK1~(-/-)假手术组小鼠肌肉蛋白降解率的差异不显著(P0.05),而ROCK1~(-/-)CKD组小鼠的肌肉蛋白降解率相较于ROCK1~(+/+)CKD组显著下降(P0.05)。对比于ROCK1~(+/+)CKD组,Atrogin-1和MuRF-1的mRNA水平在ROCK1~(-/-)CKD组小鼠中显著降低(P0.01),而该组的Akt活性较高,PTEN活性较弱(P0.01)。推测小鼠CKD时激活ROCK1,继而激活PTEN,引起Akt活性下降,而ROCK1基因敲除可抑制该现象。4、激活的ROCK1通过PTEN抑制Akt的活性:C2C12细胞用Caspase-3激活ROCK1后PTEN活性显著升高(P0.01),Akt活性显著下降。Fasudil可抑制PTEN活性(P0.05),促进Akt激活。推测激活的ROCK1升高了PTEN的活性从而抑制Akt的活性。5、ROCK1抑制剂法舒地尔可延缓CKD小鼠的肌肉萎缩:CKD组小鼠的肌力较对照组显著下降,法舒地尔则可改善小鼠CKD引起的肌力降低(P0.05)。胫骨前肌、趾长伸肌和比目鱼肌称重可得,CKD明显降低了小鼠的肌肉重量,该症状经法舒地尔干预后可得缓解(P0.05),体质量经法舒地尔干预后有所回升(P0.05)。法舒地尔可增加CKD小鼠肌纤维横截面积(P0.05),使肌纤维横截面积分布率较CKD组右移。与此同时,法舒地尔干预后,磷酸化Akt的水平较CKD组显著回升(P0.05),Atrogin-1和MuRF-1 mRNA表达下降(P0.01)。由此可得ROCK1抑制剂对CKD所致肌肉萎缩的治疗作用。结论:1、慢性肾脏病时ROCK1的激活介导了PTEN活化,抑制Akt的活性从而增加Atrogin-1和MuRF-1的表达,促进肌肉萎缩。2、法舒地尔可延缓慢性肾脏病所致的肌肉萎缩,为临床治疗提供理论依据。
【关键词】：慢性肾脏病 ROCK1 肌肉萎缩 法舒地尔
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 中英文缩略词对照表9-10
• 前言10-14
• 实验装置与方法14-20
• 一、实验动物和细胞14-15
• 二、实验器材与方法15-19
• 三、统计学处理19-20
• 结果20-25
• 一、CKD抑制PI3K的活性但AKT活性下降更为显著，且PTEN被激活20-21
• 二、ROCK1在CKD小鼠的骨骼肌中被激活21-22
• 三、ROCK1全身敲除可拮抗CKD导致的肌肉萎缩22-23
• 四、激活的ROCK1通过PTEN抑制AKT的活性23-24
• 五、ROCK1抑制剂法舒地尔可延缓CKD小鼠的肌肉萎缩24-25
• 讨论25-28
• 结论28-29
• 参考文献29-33
• 综述 慢性肾脏病与肌肉萎缩33-48
• 参考文献42-48
• 在读期间已发表论文48-49
• 致谢49

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本文编号：473046