HIF-1α在男性不育症发生机制中的作用研究

发布时间：2017-06-23 16:04

  本文关键词：HIF-1α在男性不育症发生机制中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景 随着社会发展，不孕不育症的发生率越来越高。据中国人口协会调查数据显示，我国不孕不育症患者已超过4000万，占育龄人口（25-30岁）的12.5%，平均每8对夫妻中就有1对不孕不育症患者。由男性因素引起的不育症比例达到了50%，且有逐年上升趋势。男性不育病因复杂，除了生殖系统病变外，双酚A，，重金属，吸烟等环境毒物及糖尿病等疾病均可能造成睾丸生精功能的损伤，降低精子数量和质量，导致男性不育，性功能障碍及流产、胎儿畸形等，严重损害了家庭的和谐和人口的质量和数量。 睾丸间质细胞（Leydig cell）又被人们叫做睾丸间隙细胞。其主要功能是分泌与合成雄激素(包括孕烯醇酮、睾酮等)，刺激雄性内外生殖器的发育成熟。如果Leydig cell功能障碍，将会导致男性原发性性腺功能低下，引起男性不育症。由于氧化应激（OS）是多种物理化学、生物因素等共同损伤男性生殖能力的方式。因此探寻OS引起生殖细胞的不同程度的损伤、寻找有效控制生殖细胞氧化应激的方法将是男性不育治疗最有前途的策略之一。HIF-1α作为细胞组织在适应低氧环境的重要调节因子，深入探寻其在睾丸间质细胞氧化应激中的调控机制将会对治疗男性不育方面提供一定的理论基础。 目的 了解HIF-1α在男性不育症发生中的作用，针对作用机理探讨治疗男性不育症的治疗方法。 方法 （1）小鼠睾丸间质细胞TM3细胞的培养，分为五部分处理： 第一部分是使用50μg/ml AGES；另外一组仅使用完全培养基，两组都培养48h。处理好的细胞进行以下（2）、（3）、（4）步骤操作。 第二部分是先通过使用干扰HIF-1α转染，24h之后加入50μg/ml AGES培养24h；另外一组仅仅是转染的阴性干扰质粒，经过24h之后，给予50μg/ml AGES，再培养24h。处理好的细胞进行以下（2）、（3）、（4）步骤检测操作。 第三部分是在预先给与500μm DMOG24h后给予50μg/ml AGES培养48小时；对照预先给予0.1‰DMSO24h后给予50μg/ml AGES培养48小时。处理好的细胞进行以下（2）、（3）、（4）步骤操作。 第四部分是给予干扰HIF-1α质粒转染并且培养48h；另外一组仅仅是转染的阴性干扰质粒培养48h之后。处理好的细胞进行以下（2）、（3）、（4）步骤检测操作。 第五部分是在预先给与500μm DMOG培养48h；对照预先给予0.1‰DMSO后培养48h。处理好的细胞进行以下（2）、（3）、（4）步骤检测操作。 （2）应用western-blotting检测各组细胞HIF-1α， Caspase3，HO-1，sTAR和CYP17A1的表达。 （3）应用流式细胞仪Annexin V-FITC染色检测细胞凋亡。 （4）检测各组细胞细胞内活性氧(ROS)的浓度。 结果 1.各组细胞的ROS浓度 1.1AGES组实验组ROS含量为（11.01±0.39），对照组ROS含量为（9.73±0.25)，实验组ROS含量显著高于对照组，（P=0.0189）。表明小鼠睾丸间质细胞给予AGES处理48h后ROS含量增加。 1.2HIFsiRNA+AGES组实验组的ROS含量（9.38±1.25）显著高于对照组（6.931±0.532），（P=0.0354），表明经HIFsiRNA并给予后50μg/ml AGES后小鼠睾丸间质细胞ROS含量增加。 1.3HIFsiRNA组实验组ROS含量（15.03±0.3861）与对照组(9.733±0.2471)比较有显著性升高，（P=0.0003），表明HIF能增加TM3细胞中的ROS含量。 1.4DMOG+AGES组实验组ROS含量(5.513±0.402)显著低于对照组(10.014±0.694)（,P=0.0006）。表明给予500nmol/ml DMOG24h后再给予50μg/mlAGES培养48小时后，TM3细胞ROS含量降低。 1.5DMOG组实验组ROS含量(5.445±1.993)显著低于对照组（9.733±0.2471），两者比较差异不显著，（P=0.0996）。表明两组细胞变化不大。 2.各组细胞的凋亡率 2.1AGES组早期凋亡率实验组为（7.440±0.54）%，显著高于AGES组对照组(1.370±0.0600)%，（P=0.0079），AGES组晚期凋亡率实验组为（18.79±1.09）%，显著高于对照组（10.42±0.48）%，（P=0.0197）。AGES组总凋亡率实验组为（28.68±0.82）%，显著高于对照组（11.84±0.465）%，（P=0.0031）。 2.2DMOG组实验组早期凋亡率为（0.745±0.035）%显著低于DMOG组对照组(1.370±0.06)%，（P0.001）；DMOG组实验组晚期凋亡率为（9.45±0.45）%与DMOG组对照组(10.42±0.48)%比较差异不显著，（P=0.2783）；DMOG组实验组总凋亡率为（9.845±0.835）%与DMOG组对照组(11.84±0.465)%相比差异不显著，（P=0.1728）。 2.3DMOG+AGEs组实验组早期凋亡率为（1.547±0.029）%比DMOG+AGEs组对照组（1.267±0.081）%显著升高，（P=0.0314）；DMOG+AGEs组实验组晚期凋亡率为（11.36±0.44）%比其对照组（17.37±0.59）%显著降低，（P=0.0012）；DMOG+AGEs组实验组总凋亡率（12.91±0.415）%与其对照组（18.64+0.669）%也显著降低，（P=0.0019）。 2.4HIFsiRNA组实验组的早期凋亡率为（1.25±0.06）%与其对照组(0.745±0.035)%相比较没有太大的变化，（P=0.2929）；HIFsiRNA组实验组晚期凋亡率为（3.75±0.15）%显著低于其对照组(10.42±0.48)%，（P=0.0056）；HIFsiRNA组实验组总凋亡率为（4.595±0.495）%显著低于其对照组(11.84±0.465)%有，（P=0.0087）。 2.5HIFsiRNA+AGES组实验组的早期凋亡率为（5.84±0.5）%显著低于其对照组(8.155±0.175)%，（P=0.0486）。HIFsiRNA+AGES组实验组的晚期凋亡率（11.02±0.30）%显著低于其对照组（2）(18.55±1.335)%，（P=0.0316）。HIFsiRNA+AGES组实验组的总凋亡率（16.86±0.19）%显著低于其对照组(26.7±1.16)%，（P=0.014）。 3.各组细胞的蛋白表达 3.1HIF-1α蛋白的表达 HIF-1α蛋白表达在AGES组实验组细胞的HIF蛋白的相对表达量(0.1999±0.02627)比其对照组（1）(0.3487±0.01257)有显著性降低，（P=0.0069）。在DMOG组实验组中相对表达量(0.4367±0.01449)比其对照组（5）(0.3487±0.01257)显著性升高， P=0.0101。HIF-1α蛋白表达在HIF-1α siRNA组中，实验组被成功降低了表达，转染效率约70%，敲低表达约45%。在DMOG+AGES组实验组中相对表达量(0.2548±0.01085)比其对照组(0.1999±0.02627)无显著差异，P=0.1253。在HIF-1α siRNA+AGES组实验组中相对表达量(0.2011±0.01438)比对照组(0.1999±0.02627)无显著差异， P=0.9697。 3.2Caspase3蛋白的表达 Caspase3蛋白在AGES组实验组中相对表达量(0.3410±0.0131)与其对照组(0.4297±0.0293)比较无显著性差异，（P=0.0503）。在DMOG组实验组中相对表达量(0.4758±0.0269)与其对照组(0.4297±0.0293)比较无显著性差异， P=0.3109。在HIF-1α siRNA组实验组中相对表达量(0.3003±0.02016)比其对照组(0.6539±0.04475)显著性降低， P=0.0020。在DMOG+AGES组实验组中相对表达量(0.4772±0.0492)与其对照组(0.5525±0.03144)比较无显著性差异，P=0.2665。在HIFsiRNA+AGES组实验组中的相对表达量(0.2855±0.022)低于其对照组(0.341±0.13)，P=0.0948。 3.3HO-1蛋白的表达 HO-1蛋白在AGES组实验组中相对表达量(0.2265±0.01211)比其对照组(0.3852±0.02199)有显著性降低，（P=0.0032）。在DMOG组实验组中相对表达量(0.4223±0.008370)与其对照组(0.3852±0.02199))相比较没有显著性差异，P=0.1907。在HIF-1α siRNA组实验组中相对表达量(0.3418±0.02062)与其对照组(0.3852±0.02199)相比较没有显著性差异， P=0.2231。在DMOG+AGES组实验组细胞的HO-1基因蛋白的相对表达量(0.4638±0.05544)与其对照组(0.2265±0.01211)相比显著性升高，P=0.0139。在HIFsiRNA+AGES组实验组中相对表达量(0.3086±0.0154)与其对照组(0.2265±0.01211)相比显著性升高，P=0.0138。 3.4CYP17A1蛋白的表达 CYP17A1蛋白在AGES组实验组中相对表达量(0.7441±0.03956)与其对照组(0.7462±0.02578)比较无显著性差异，（P=0.9664）。在DMOG组实验组中相对表达量(0.8273±0。02107)与其对照组(0.7462±0.02578)比较无显著性差异，P=0.0715。在HIF-1α siRNA组实验组细胞中相对表达量(0.5158±0.01579)比其对照组(0.7462±0.02578)显著性降低， P=0.0016。在DMOG+AGES组实验组中相对表达量(0.7164±0.02530)与其对照组(0.7441±0.03956)比较无显著性差异，P=0.5864。在HIFsiRNA+AGES组实验组中相对表达量(0.3547±0.02325)比其对照组(0.7441±0.03956)有显著性降低， P=0.0011。 3.5StAR蛋白的表达 StAR蛋白在AGES组实验组中相对表达量(0.6734±0.04594)与是对照组(0.7984±0.03910)相比没有显著性差异，（P=0.1069）。在DMOG组实验组中相对表达量(0.7951±0.04411)与是对照组（5）(0.7984±0.03910))相比较没有显著性差异， P=0.9578。在HIFsiRNA组实验组中相对表达量(0.6420±0.05320)与其对照组(0.7984±0.03910)相比较没有显著性差异， P=0.0769。在DMOG+AGES组实验组中相对表达量(0.6291±0.05480)与其对照组(0.6734±0.04594)相比没有有显著性差异，P=0.3437。在HIFsiRNA+AGES组实验组中相对表达量(0.4163±0.02377)比其对照组(0.6734±0.04594)显著性降低， P=0.010。 结论 （1）HIF-1α可降低ROS的产生，在氧化应激引起的男性不育中发挥了调控作用； （2）AGES引起的氧化应激损伤不影响TM3细胞中的CYP17A1（P45017α1）和StAR基因的表达，但是可以介导HIF-1α对CYP17A1和StAR基因表达的调控； （3）AGEs可以导致HO-1显著下降，并介导HIF-1α对HO-1的调控。 （4）HIF-1α促进Caspase3的表达升高，从而引起TM3的凋亡。 （5）HIF-1α在氧化应激损伤中的对睾丸间质细胞的调控作用为男性不育症的诊治提供了思路。
【关键词】：男性不育症 睾丸间质细胞 低氧诱导因子（HIF） 氧化应激
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R698.2
【目录】：

• 中文摘要4-9
• Abstract9-16
• 英汉缩略语名词对照16-18
• 第1章 前言18-24
• 1.1 研究背景18
• 1.2 睾丸间质细胞(TM3) 与氧化应激18-19
• 1.3 HIF-1α的结构及其功能19-20
• 1.4 HIF 在细胞氧化应激中的作用20-22
• 1.4.1 HIF-1α与细胞凋亡20
• 1.4.2 HIF-1α和氧化应激调节20-21
• 1.4.3 HIF-1α与糖基化终末产物21-22
• 1.4.4 HIF-1α与脯氨酸羟化酶22
• 1.5 选题依据22-24
• 第2章 材料与方法24-33
• 2.1 实验对象24
• 2.1.1 细胞株24
• 2.1.2 细胞冷冻复苏24
• 2.2 实验仪器及试剂24-27
• 2.2.1 实验仪器24-25
• 2.2.2 主要试剂25-26
• 2.2.3 主要试剂的配制26-27
• 2.3 实验方法27-32
• 2.3.1 实验分组27-28
• 2.3.2 细胞处理28-29
• 2.3.3 靶向 HIF-1α的 shRNA 干扰质粒载体的构建29
• 2.3.4 筛选干扰效率最佳的 siRNA 片段29-30
• 2.3.5 细胞凋亡检测30
• 2.3.7 Western blotting 检测:30-32
• 2.4 统计学分析32-33
• 第3章 结果33-54
• 3.1 HIF 在氧化应激中对 TM3 细胞 ROS 含量的影响33-35
• 3.1.1 AGES 组 TM3 细胞 ROS 含量变化33
• 3.1.2 HIFsiRNA+ AGES 组 TM3 细胞 ROS 含量变化33
• 3.1.3 HIFsiRNA 组 TM3 细胞 ROS 含量变化33
• 3.1.4 DMOG+ AGES 组 TM3 细胞 ROS 含量变化33-34
• 3.1.5 DMOG 组 TM3 细胞 ROS 含量变化34-35
• 3.2 HIF 在氧化刺激中对 TM3 细胞凋亡的影响35-41
• 3.2.1 AGES 组 TM3 细胞的凋亡35-37
• 3.2.2 DMOG 组 TM3 细胞的凋亡37-38
• 3.2.3 DMOG+AGEs 组 TM3 细胞凋亡率的影响38-39
• 3.2.4 HIFsiRNA 组 TM3 细胞的凋亡39-40
• 3.2.5 HIFsiRNA+ AGES 组 TM3 细胞的凋亡40-41
• 3.3 HIF 调控 TM3 细胞氧化应激蛋白表达的变化41-54
• 3.3.1 HIF-1α蛋白表达41-44
• 3.3.2 HIF-1α对 TM3 细胞 Caspase 3 蛋白的调控44-46
• 3.3.3 HIF-1α对 TM3 细胞 HO-1 蛋白的调控46-48
• 3.3.4 HIF-1α对 TM3 细胞 CYP17A1 蛋白的调控48-51
• 3.3.5 HIF-1α对 TM3 细胞 StAR 蛋白的调控51-54
• 第4章 讨论54-57
• 第5章 结论57-58
• 参考文献58-63
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果63-64
• 致谢64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 戚亚伟;胡传银;陈绍红;赵云涛;刘铀;;非酶糖基化终末产物抑制大鼠睾丸Leydig细胞睾酮的生成[J];中华男科学杂志;2014年05期

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3 孙应彪;陈建华;赵健雄;朱玉真;;扶正解毒颗粒对硫酸镍致大鼠睾丸生殖细胞损伤的拮抗作用[J];毒理学杂志;2007年04期

  本文关键词：HIF-1α在男性不育症发生机制中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：475548