CUEDC2在肾间质纤维化中的作用及机制研究

发布时间：2017-07-15 19:18

  本文关键词：CUEDC2在肾间质纤维化中的作用及机制研究

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【摘要】：肾间质纤维化(Renal Interstitial Fibrosis, RIF)是各种慢性肾脏病进展至终末期肾衰竭(End-Stage Renal Disease, ESRD)的主要病理基础和共同终末途径,导致患者预后不良。但是RIF的发生机制尚未完全阐明,可能与肾间质炎症反应、肾小管上皮-间质细胞转分化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过度聚集等有关。炎症反应是间质纤维化的始动环节之一,炎症细胞(主要是巨噬细胞)浸润,可以直接通过巨噬细胞-肌成纤维细胞转化(Macrophage myofibroblast transition, MMT)过程促进纤维化的发生,还可以通过促进促炎因子的表达,进一步加重炎细胞浸润,增加细胞外基质合成,间接导致纤维化的发生。炎症因子的表达在纤维化中也有重要作用,可以促进单核／巨噬细胞、淋巴细胞和肾间质细胞的浸润和增殖分化,刺激促炎及促纤维化细胞因子表达,导致细胞外基质合成增加和大量积聚,使损伤肾脏的炎症反应加重,加速间质纤维化进展。EMT主要表现为小管上皮细胞丢失固有的表型标志蛋白,表达间质细胞蛋白,出现成纤维细胞样改变,具有较强的侵袭和迁移能力,而且还可以分泌多种细胞因子,参与炎症反应和纤维化的发生过程。而TGF-β1在EMT的发生中起着重要的作用,是参与纤维化过程的关键性调节因子,主要通过Smad信号蛋白发挥其生物学效应。TGF-β是具有多种功能的细胞因子,参与多条信号通路转导,包括samd蛋白依赖性和smad蛋白非依赖性信号转导途径。TGF-β可以调节多种病理生理过程,是细胞生长调节因子,可以抑制大多数细胞的生长,但是却可以刺激间叶细胞的生长,促进细胞外基质蛋白的产生,导致肾小球硬化及肾小管间质纤维化。与TGF-β/Smads信号通路相关的蛋白主要包括TGF-β1受体调控信号蛋白(Smad2, Smad3)、抑制性信号蛋白(Smad7)和共同作用信号蛋白(Smad4), TGF-β1与其受体结合,磷酸化Smad2、Smad3蛋白,与Smad4结合形成寡聚体复合物,一起进入细胞核,调节基因转录过程,使细胞外基质积聚,导致肾脏的纤维化。因此,抑制TGF-β/Smads信号转导通路可以抑制EMT发生和肾间质纤维化进展。有多种蛋白可以参与负性调节EMT过程。Smad7蛋白分子在TGF-β信号转导通路中是主要的抑制性蛋白质,通过招募E3泛素连接酶,导致TGF-β的I型受体(TβRI)和Smad2, Smad3蛋白的泛素化降解；招募蛋白磷酸酶I(PP1c)到TβRI,使其去磷酸化失活,阻断TGF-β信号转导途径。研究表明,肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)可以特异性上调Smad2和Smad3蛋白的转录共抑制子SnoN表达,抑制TGF-β1靶基因的激活,从而抑制TGF-β诱导的EMT的作用。此外,热休克蛋白72(HSP72)可以与Smad3及p-Smad3蛋白相互作用,抑制TGF-β诱导的磷酸化和核易位,抑制EMT的发生。还可以抑制a-SMA、Fibronectin等间质蛋白的表达,阻断STAT3信号通路的下游信号分子的表达,抑制STAT3信号转导通路。HSP72可通过多种途径来抑制肾间质纤维化过程。还有研究表明,骨形成蛋白-7(BMP-7)是TGF超家族的亚家族成员,也是一种负性调节蛋白,可以通过阻断小管上皮细胞的凋亡、减少细胞外基质的积聚,抑制TGF诱导的EMT和纤维化。CUE结构域蛋白2 (CUE domain containing protein 2, CUEDC2)是一个功能尚不明确的新蛋白质,含有一个保守的结构域,广泛存在于多种真核细胞中,可以参与调节细胞周期、生长因子信号转导、炎症反应发生及肿瘤的发生。CUEDC2可以识别单泛素化及多泛素化,促进蛋白质的泛素化及降解。CUEDC2能与孕激素受体结合,抑制乳腺癌细胞的生长,导致乳腺癌内分泌治疗的耐药。CUEDC2在多种肿瘤中有不同表达,如在卵巢癌、肾癌中高表达,在肺癌中低表达,提示在不同的肿瘤组织中CUEDC2蛋白发挥的作用可能是不同的。此外,CUEDC2可以阻断NF-κB通路,调节巨噬细胞的功能,在炎症反应中发挥作用。而且NF-κB的活化与UUO的发病机制有关,阻断这条通路,可以抑制UUO的炎症反应。但是,CUEDC2蛋白在肾脏纤维化中的作用尚未有阐述,本实验主要是通过建立纤维化模型来探讨CUEDC2在肾纤维化中的作用及其可能的机制。(一) CUEDC2蛋白对单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠肾组织炎症反应的作用目的：研究CUEDC2蛋白在单侧输尿管梗阻小鼠肾组织炎症反应中的作用。方法：建立单侧输尿管梗阻模型：清洁级balb/c小鼠30只(购自中山大学医学实验动物中心),将小鼠随机分为假手术组(sham-vector)、UUO组(uuo-vector)、CUEDC2质粒转染治疗组(uuo-cuedc2),每组分别有10只小鼠。UUO组及质粒转染治疗组均行单侧输尿管梗阻手术,即将右侧输尿管进行游离并结扎离断,而假手术组只游离右侧输尿管,不进行结扎离断。采用超声微泡联合穿膜肽技术分别在术前1天、术后1天及术后7天给三组动物实验小鼠进行质粒转染,假手术组和UUO组转染对照质粒,治疗组转染cuedc2质粒。质粒均经由尾静脉注入。于术后第7天和第14天分别处死小鼠,每组5只。留取组织标本时,采集各组小鼠血液,离心吸取上清,-80℃保存备用。灌流冲洗,待肾脏变白后小心剥离右侧肾脏,去除包膜,将肾组织分为不同小块,留做免疫组化或用于提取组织蛋白。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测炎症因子细胞间黏附分子-1(ICAM-1, intercellular cell adhesion molecule 1)单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1, monocyte chemotactic protein 1)、白介素-1(IL-1)、白介素-8(IL-8)表达：免疫组织化学法检测肾组织单核／巨噬细胞表面抗原(CD68)及肾脏组织中CUEDC2蛋白的表达；结果：CUEDC2免疫组化结果显示,UUO术后CUEDC2蛋白表达减少,经过质粒转染后,其表达增加(p0.05). ELISA及CD68抗原免疫组化结果显示,UUO模型组,炎症因子ICAM1、MCP1、IL1、IL8及CD68抗原表达增加,随梗阻时间延长,增多趋势更加明显(p0.05)；治疗组中炎症因子表达和CD68抗原表达下调,在各时间点均低于UUO组的表达。小结：CUEDC2蛋白可以抑制单核/巨噬细胞浸润、减少炎症因子在纤维化肾组织中的表达,减轻肾脏炎症反应,进而可以抑制肾脏纤维化的发生。(二) CUEDC2在肾间质纤维化中的作用及其可能机制(1)体外细胞实验目的：探讨CUEDC2蛋白在肾小管上皮细胞(HK2细胞)EMT中的作用及可能机制。方法：5ng/ml TGF-p1刺激HK2细胞,共6个时间点,诱导其EMT模型形成。用试剂盒提取vector和cuedc2目标质粒,制备慢病毒,用磷酸钙转染法构建稳定过表达目标质粒的HK2细胞系,之后同样用TGF-p1来刺激细胞,调整为刺激4个时间点。Western免疫印迹检测CUEDC2、Fibronectin、E-cadherin、 Vimentin、p-smad2、p-smad3和smad2、smad3蛋白的表达。结果：TGF-p1刺激HK2细胞,使其E-cadherin蛋白表达下调,Fibronectin蛋白表达上调,随刺激时间延长,这种变化趋势愈加明显,表明TGF-β诱导的EMT模型已经成功建立,此时,CUEDC2蛋白随梗阻时间延长,表达量逐渐下调。TGF-β1分别刺激过表达vector及cuedc2的HK2细胞,CUEDC2蛋白表达在稳定过表达组较对照组明显增加,表明稳定过表达细胞系构建成功。此时,与对照组相比,CUEDC2稳定过表达组中,在刺激的各时间点,E-cadherin蛋白表达增加,Fibronectin、Vimentin蛋白表达下降,p-smad2和p-smad3蛋白表达减少。小结：CUEDC2蛋白在TGF-P诱导的EMT中表达下调,过表达CUEDC2可以减少间质表型蛋白表达,增加上皮表型蛋白表达,抑制smad2和smad3蛋白的磷酸化表达,抑制TGF-β1诱导的EMT, CUEDC2可能参与了EMT的负性调节过程。(2)体内实验目的：探讨CUEDC2蛋白在梗阻性肾病对间质纤维化的影响及其可能的机制。方法：UUO模型建立及组织标本收集,同上。HE及Masson染色观察肾脏病理改变,Western Blot用于检测肾组织中CUEDC2、Fibronectin、E-cadherin、 p-smad2、p-smad3等蛋白的表达。结果：CUEDC2质粒转染治疗组,UUO术后7d及14d,肾组织的小管变性坏死程度、间质炎细胞浸润和纤维化改变程度较UUO组明显减轻,肾间质的蓝染面积与UUO组相比显著降低。经CUEDC2质粒转染治疗后,CUEDC2蛋白表达上调,E-cadherin蛋白表达量增加,Fibronecti、Collagen I、p-smad2、 p-smad3蛋白表达量降低。小结：CUEDC2在UUO肾纤维化中,可以减轻肾小管损害程度,减少间质胶原的沉积,抑制细胞外基质合成,抑制p-smad2和p-smad3蛋白的表达,抑制肾间质纤维化。结论：CUEDC2蛋白在细胞EMT模型和动物UUO模型中均表达下调,是一种负性调节蛋白；CUEDC2蛋白通过抑制炎性细胞浸润、减少炎症因子的表达,减弱纤维化的炎症反应；通过减少间质的胶原沉积,抑制肾组织smad2、 smad3蛋白磷酸化,增加smad7蛋白的表达,抑制TGF/smad信号通路激活,抑制EMT过程,进而减轻肾脏纤维化程度,有一定的肾脏保护作用。
【关键词】：CUEDC2 炎症因子 间质纤维化 上皮间质细胞转分化TGF-β/s mad信号通路 单侧输尿管梗阻
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-20
• 第一部分 CUEDC2对梗阻性肾病肾组织炎症反应的作用20-37
• 1.1 研究目的20
• 1.2 实验材料及方法20-30
• 1.3 实验结果30-34
• 1.4 讨论34-37
• 第二部分 CUEDC2在肾间质纤维化中的作用及可能机制37-56
• 2.1 研究目的37
• 2.2 实验材料及实验方法37-44
• 2.3 实验结果44-51
• 2.4 讨论51-56
• 参考文献56-61
• 综述61-64
• 致谢64-66

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本文编号：545369