HPIP在肾癌中的功能研究

发布时间：2017-07-26 04:05

  本文关键词：HPIP在肾癌中的功能研究

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【摘要】：肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)为泌尿系统常见恶性肿瘤之一,发病率仅次于膀胱癌,位居第二位。早期肾癌常无明显症状,当患者出现典型“腰痛、血尿、腹部包块”症状时多已进入临床晚期。肾癌因其独特生物学特性,常规放疗、化疗均难以获得满意疗效,转移性肾癌患者5年生存率只有大约10%。因此进一步明确肾癌发生发展及转移的分子机制,对晚期肾癌的治疗策略可能提供潜在的理论依据。人造血相关的PBX相互作用蛋白质(hematopoietic PBX—interacting protein,HPIP)最早由Abramovich发现,具有调节前B细胞白血病转录因子(PBXS)的功能。近年来,国内外研究团队相继撰文显示,HPIP在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。HPIP在多种肿瘤细胞系及肿瘤组织中表达,可以通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭能力,且在结肠癌、胃癌中HPIP高表达提示患者预后较差,但是目前尚无HPIP在肾癌中功能的报道。我们前期通过酵母双杂交技术发现,酪蛋白激酶I?(CK1?)为HPIP的相互作用蛋白之一,进一步研究表明HPIP和CK1?在肾细胞癌的发生发展过程中起重要作用。首先,我们选取119例肾癌患者手术标本切片,行免疫组化检验癌组织和癌旁组织HPIP表达水平,Mann-Whitney U秩和检验比较癌组织和癌旁组织间HPIP表达差异,结果表明HPIP在肾癌组织中表达高于癌旁组织;Kaplan-Meier生存曲线显示:HPIP表达水平与肾细胞癌预后负相关,HPIP高表达提示患者预后较差。接下来,为深入研究CK1?和HPIP在细胞内的相互作用,我们在293T细胞同时转染Flag-CK1?和Myc-HPIP质粒,Flag beads偶联细胞裂解物,免疫共沉淀后行Western blotting印记发现Myc-HPIP可以被FLAG-CK1?特异性沉淀下来,初步说明两者间存在相互作用;之后我们在肾癌细胞株Caki-1和786O中行内源性免疫共沉淀实验,发现在生理条件下CK1?和HPIP间同样存在相互作用,免疫荧光显示,内源性CK1?和内源性HPIP共同定位于细胞质内,进一步说明了CK1?是?PIP的特异性相互作用蛋白;为进一步研究CK1?与?PIP特异性结合的区域,我们表达纯化了HPIP各段结构域的GST融合蛋白:GST-HPIP(1 100),GST-HPIP(101 220),GST-HPIP(221 361),GST-HPIP(362 541),GST-HPIP(542 731),与转染了Flag-CK1?的293T细胞裂解物行GST pull-down实验,结果显示CK1?特异性结合在HPIP(542 731aa)结构域,与HPIP其他结构域不结合,说明HPIP的C末端区是与CK1?相互作用的重要区域。之后我们通过慢病毒感染,在肾癌细胞株786o中过表达hpip或hpip(1-541aa),在caki-1中敲低hpip表达,cck8法评估细胞生长速度,发现hpip能显著促进786o细胞生长,而缺失与ck1?相互作用结构域的hpip(1-541aa)对肾癌细胞生长促进不明显,说明ck1?可能参与了hpip对细胞生长的调控作用;另外,敲低hpip表达能显著抑制caki-1细胞生长,而在caki-1中敲低ck1?后,hpip丧失了调控细胞生长的功能;用上述细胞行平板克隆形成实验取得一致结果,说明hpip调控肾癌细胞生长依赖于和ck1?的相互作用。然后为进一步研究hpip和ck1?对肾癌细胞迁移和侵袭的影响,我们进行了划痕实验和transwell侵袭实验,结果显示:过表达hpip能明显促进肾癌细胞的迁移和侵袭,而过表达hpip(1-541aa)对此则无明显促进作用;与此相反,敲低hpip能明显抑制肾癌细胞的迁移和侵袭,而敲低ck1?则抑制了hpip调控肾癌细胞迁移和侵袭的能力;westernblotting印记显示:hpip可以下调e-cadherin表达水平,同时上调n-cadherin和vimentin,hpip(1-541aa)则无明显作用;敲低hpip后相关蛋白表达呈相反变化,并且敲低ck1?后hpip对上述蛋白的调控能力明显变弱;说明ck1?在hpip促进肾癌细胞迁移、侵袭和上皮间质转化中其重要作用。接下来,为明确hpip调控肾癌细胞生长和迁移是否依赖于mtor通路,我们在过表达hpip的786o和对照组细胞中加入雷帕霉素(mtor通路抑制剂)处理,生长曲线和划痕实验结果显示:在阻断mtor通路的情况下,hpip促进细胞生长和迁移的能力明显下降;westernblotting检测表明,hpip上调mtor、p-mtor、p-s6k1表达水平,而敲低ck1?可以显著减弱这种调节作用,说明hpip通过激活mtor通路参与调节肾癌细胞生长和迁移,且这种激活过程部分依赖于和ck1?的相互作用。再次,我们在肾癌动物模型上验证了hpip和ck1?对肿瘤生长的影响,结果显示hpip或ck1?敲低后肿瘤生长速度明显减慢,并且ck1?敲低抑制了hpip对肿瘤生长的调控作用,肿瘤组织westernblotting检测结构与细胞实验一致。最后,我们在上述119例患者标本中行免疫组化检验癌组织和癌旁组织ck1?表达水平,行统计学分析发现ck1?在癌组织中高表达,且肿瘤组织中ck1?高表达提示预后不良;进一步统计分析患者肿瘤组织中ck1?和hpip免疫组化评分,发现两者间水平呈正相关,说明ck1?和hpip在肾癌的病理发展中起重要作用。综上所述,我们的研究首次发现了hpip在肾癌中的重要作用,并且筛选并确定了hpip的一个新的相互作用蛋白:ck1?;ck1?特异性结合在hpip(542 731aa),在hpip发挥促进肾癌细胞生长、迁移、侵袭和上皮间质转化等功能中起重要作用;分子机制方面,hpip激活mtor需要部分依赖于ck1?。因此,进一步研究hpip和ck1?在肾癌中的功能及分子机制,抑制hpip或ck1?表达可能成为肾癌治疗的潜在策略。
【关键词】：肾细胞癌 人造血相关的PBX相互作用蛋白质 酪蛋白激酶 预后
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.11
【目录】：

• 缩略词表4-5
• 中文摘要5-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-13
• 材料与方法13-20
• 1.材料13-15
• 2.方法15-20
• 结果20-33
• 1.RCC中HPIP的表达及临床意义20-21
• 2.筛选并确定CK1α为HPIP新的相互作用蛋白21-23
• 3.HPIP通过与CK1α相互作用促进肾癌细胞生长23-25
• 4.HPIP可以促进肾癌细胞CK1α依赖的迁移、侵袭能力和EMT25-27
• 5.HPIP调控肾癌细胞生长和迁移部分依赖于CK1α激活的mTOR通路27-29
• 6.动物模型中HPIP通过CK1α调控肾癌细胞生长和EMT29-30
• 7.RCC中CK1α的表达及HPIP与CK1α表达的相关性30-33
• 讨论33-35
• 结论35-36
• 参考文献36-39
• 论著39-62
• 个人简历62-63
• 致谢63

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本文编号：574625