新型PPARγ激动剂对人肾癌细胞增殖抑制及其机制的研究

发布时间：2017-08-09 01:27

  本文关键词：新型PPARγ激动剂对人肾癌细胞增殖抑制及其机制的研究

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【摘要】：研究目的:过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisome proliferator-actived receptors gamma,PPARγ)属于核受体超家族一份子,表达于心、肝、肾、骨骼肌、卵巢和胎盘等多种人体组织中。自从上个世纪以来,以PPARγ为靶点的药物,尤其是噻唑烷二酮类PPARγ激动剂(TZDs),为糖尿病的临床预防和治疗提供了新的思路。近年来研究发现,PPARγ除了对人体的糖脂代谢具有重要意义外,还与肺,乳腺,结肠,前腺、膀胱和肾脏等部位的肿瘤关系密切。在肾癌中,PPARγ激动剂能够显著抑制肾癌细胞增殖,减轻化疗药的肾毒性,有望成为临床治疗肾癌的新药。然而,自TZDs类药物上市以来,其肝毒性、致水钠潴留及增加心衰发生率等严重副作用限制了该类药物的长期使用。因此,寻找取代TZD类的新型PPARγ激动剂,对于肾癌的药物研发具有非常重要的现实意义。为此,我们与中科院上海药物研究所合作,通过计算机虚拟筛选方法获得的1种新型PPARγ激动剂DH9。前期体外肿瘤学研究发现,DH9的PPARγ受体激动能力较弱,但却显示出比TZDs类更强的抗肿瘤活性。荷瘤裸鼠模型(MGC-803、NCI-H460)上研究进一步发现,化合物DH9对体重及重要脏器影响较小,适合长期给药,具有治疗肾癌的潜在优势,值得进一步探索研究。本研究利用体外培养的肾癌细胞系OS-RC-2细胞,探讨新型PPARγ激动剂DH9能否在体外发挥较强的抗肾癌细胞活性,并在此基础上进一步探究其作用机制,为将来临床上开发更加安全有效的抗肾细胞癌新药夯实理论基础。研究方法:1.予不同浓度的DH9(0、6.25、12.5、25、50和100μmol/L)或罗格列酮(0、25、50、100、150和200μmol/L)分别干预人肾癌OS-RC-2细胞24、48和72小时,MTT检测OS-RC-2细胞增殖情况。采用相同浓度(0、6.25、12.5、25、50和100μmol/L)的DH9和罗格列酮干预OS-RC-2细胞48小时,MTT检测细胞增殖情况。2.予PPARγ特异性拮抗GW9662预处理人肾癌OS-RC-2细胞2小时,再加入不同浓度的DH9(0、6.25、12.5、25、50和100μmol/L)干预48小时,MTT检测GW9662干预前后DH9增殖抑制率的变化。为进一步验证PPARγ非依赖途径参与DH9增殖抑制过程,我们应用si RNA技术抑制PPARγ基因在OS-RC-2细胞内的表达。PPARγsi RNA转染48小时后收集全细胞裂解物,Western印迹法观察细胞PPARγ表达的改变。予不同浓度DH9(0、6.25、12.5、25、50和100μmol/L)干预OS-RC-2细胞48小时,MTT检测转染前后细胞增殖情况。3.应用流式细胞技术,观察不同浓度DH9(0、20、40和80μmol/L)作用人肾癌OS-RC-2细胞48小时后细胞周期的改变,Western印迹法检测细胞周期相关蛋白P27 KIP1及Cyclin D1的变化;采用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术,测定不同浓度DH9(0、20、40和80μmol/L)干预下细胞凋亡率,Western印迹法分析凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。研究结果:1.MTT结果显示,罗格列酮抑制OS-RC-2细胞增殖的起效浓度高,起效时间滞后,作用48小时后才能发挥其增殖抑制效应(P0.05)。而DH9的起效浓度较低,作用24小时即可起效,48小时后可显著抑制肾癌细胞增殖。此外,相同浓度的罗格列酮及DH9(0、6.25、12.5、25、50和100μmol/L)干预OS-RC-2细胞48小时,DH9的增殖抑制作用明显优于罗格列酮(P0.05)。2.GW9662预处理人肾癌OS-RC-2细胞增殖2小时后,再予不同浓度DH9作用48小时,MTT结果显示PPARγ特异性拮抗剂不能拮抗DH9的增殖抑制效应(P0.05)。取不同浓度DH9(0、6.25、12.5、25、50和100μmol/L)处理转染前后的OS-RC-2细胞48小时,MTT结果显示PPARγ小干扰RNA表达质粒稳定转染对药物的增殖抑制的影响无统计学意义(P0.05)。3.流式细胞术显示,不同浓度(20、40和80μmol/L)DH9干预48小时后可干扰细胞周期。与对照组(0μmol/L)相比,DH9可导致G0/G1期细胞大量增加(P0.05),S期细胞大量减少(P0.05),且呈现一定的剂量依赖性,而G2/M期细胞无明显变化(P0.05)。Western印迹分析显示,随DH9干预浓度的升高,G1期相关的cyclin D1蛋白表达逐渐减弱,而P27 KIP1蛋白表达逐渐增强。4.Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术结果显示,DH9可以诱导细胞凋亡。浓度为20μM、40μM和80μM的DH9作用OS-RC-2细胞48小时,凋亡率依次为为4.34±0.97%,13.52±0.87%和23.69±1.9%,显著高于对照组1.81±0.14%(P0.05),且与药物浓度之间存在一定的依赖关系。Western印记显示抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量随DH9浓度的增加有逐渐减少趋势,而促凋亡蛋白Bax表达量随药物浓度增加逐渐增多。研究结论:结合上述三部分结果,我们得出结论:OS-RC-2细胞中,DH9的增殖作用明显优于罗格列酮,且是通过PPARγ非依赖途径实现。这种增殖抑制作用与DH9作用细胞周期的不同调节点,促进OS-RC-2细胞凋亡有关。
【关键词】：肾细胞癌 PPARγ受体激动剂 细胞增殖 周期阻滞 凋亡
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.11
【目录】：

• 英文缩略表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 第一部分：DH9对人肾癌OS-RC-2细胞增殖抑制的研究14-23
• 引言14
• 1 实验材料14-15
• 2 实验方法15-17
• 3 结果17-21
• 4 讨论21-23
• 第二部分：DH9对人肾癌OS-RC-2细胞周期及凋亡的影响23-32
• 引言23
• 1 实验材料23
• 2 实验方法23-24
• 3 结果24-29
• 4 讨论29-32
• 结论32-33
• 参考文献33-39
• 附录39-40
• 文献综述40-47
• 参考文献43-47
• 个人简历47-48
• 致谢48

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