Notch信号调控髓系细胞参与肾纤维化的机制研究

发布时间：2017-08-09 16:27

  本文关键词：Notch信号调控髓系细胞参与肾纤维化的机制研究

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【摘要】：【研究背景】全球约有13%-15%的成年人患有慢性肾脏病(Chronic renal disease,CKD),肾脏纤维化是慢性肾脏病进展性损伤的共同病理过程,其主要病理改变是细胞外基质蛋白(胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白)的大量产生和堆积。此外肾纤维化导致肾实质细胞损害,小管上皮丧失再生能力,间质毛细血管的完整性受损,进一步导致组织局部缺氧,加重损伤和纤维化。随着病情进展,肾功能进行性减退,发展为肾衰竭,患者可能需要血液透析、腹膜透析和肾移植这些肾脏替代治疗,但多数患者会死于慢性肾脏病的并发症,如:心血管疾病。因而,研究肾纤维化发病的细胞学和分子机制具有重要的临床意义。肾纤维化的主要特征是细胞外基质的沉积,研究表明:细胞外基质的主要来源是肌成纤维细胞(Myofibroblast,MFB)。在损伤因素刺激下,成纤维细胞活化为MFB,血管内皮细胞向MFB转变(Endothelial to mesenchymal transition,End MT),肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转变(Epithelial to mesenchymal transition,EMT),周细胞向肌成纤维细胞转化,以及骨髓来源的细胞在损伤因素刺激下也可以向肌成纤维细胞转变。除肌成纤维细胞外,单核巨噬细胞、树突状细胞(Dendritic cells,DCs)、粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞在肾纤维化的进展中也发挥重要作用。肾脏损伤后,损伤的实质细胞会释放一系列炎性介质、趋化因子,募集炎性细胞到肾脏间质,此外肾脏固有的免疫细胞在损伤因素刺激下会发生活化,研究表明募集的炎性细胞和肾脏原位活化的免疫细胞共同参与肾纤维化的发生发展。然而,炎性细胞参与肾纤维化的详细调控机制尚不清楚。Notch信号途径是进化上高度保守的信号通路,可以调控胚胎发育以及成体组织稳态。研究表明Notch信号不仅参与淋巴细胞的发育,也参与髓系细胞的发育,尤其对巨噬细胞和树突状细胞的活化发挥重要作用。巨噬细胞和树突状细胞在一些关键性生长因子作用下由骨髓中共同前体细胞发育而来。肾脏树突状细胞(DCs)属于髓系细胞,主要位于肾间质,是经典的抗原提呈细胞(Antigen presenting cells,APC),能够对内源性和外源性的有害信号做出反应,起始和引发针对抗原的免疫反应,从而诱导免疫耐受功能,保护肾脏免受感染。树突状细胞参与多种肾脏疾病的发生与发展,并参与后续的组织再生。Notch信号可以调控树突状细胞的活化,Notch信号调控树突状细胞在肾脏病中的研究尚未见报道。大量研究证实巨噬细胞在肾纤维化过程中具有促纤维化形成以及促纤维化降解的双重作用。巨噬细胞主要位于肾小球周围,在髓质肾小管周围也可见到巨噬细胞。巨噬细胞是造血系统中可塑性最强的一种细胞,在正常发育、体内平衡、组织修复和对病原体的免疫反应中起很多不同作用,作为非经典的APC,其主要功能是维持组织稳态,吞噬清除自身组织碎片以及异物。巨噬细胞在肾纤维化过程中可以发挥促炎、促纤维化、以及促纤维化降解作用。巨噬细胞的异质性可能决定其对肾纤维化的双重作用。也可以根据其来源不同将巨噬细胞分为炎性巨噬细胞和组织定居巨噬细胞,不同来源的巨噬细胞对疾病的预后也产生不同的影响。研究证明:巨噬细胞在肾纤维化过程中发挥重要作用,但是详细的机制尚不清楚。本实验室前期研究显示,Notch信号调控巨噬细胞的极化,在巨噬细胞中特异性敲除Notch信号,肾纤维化减轻(单侧输尿管结扎模型,2周),炎性肾脏中巨噬细胞减少。提示:Notch信号途径调控巨噬细胞参与肾纤维,但分子机制尚不清楚。综上所述,本课题将利用在CD11C阳性细胞和巨噬细胞中特性剔除Notch信号的小鼠,结合单侧输尿管结扎模型(Unilateral ureteral obstruction,UUO),研究它们在肾纤维化中的作用和机制。【研究目的】利用在CD11C阳性细胞和巨噬细胞中特性剔除Notch信号的小鼠,结合单侧输尿管结扎模型(Unilateral ureteral obstruction,UUO),用免疫学和病理学等方法,从分子水平,细胞水平和动物水平,研究Notch信号调控髓系细胞参与肾纤维化的机制,以期发现治疗肾纤维化的新靶点和策略。【研究方法】1.CD11C阳性细胞和巨噬细胞剔除Notch信号,巨噬细胞过表达Notch信号等遗传修饰小鼠的培育和繁殖。2.UUO模型的建立以及纤维化水平的检测(Masson、天狼星红、免疫荧光,实时定量PCR)。3.免疫荧光、流式细胞术方法检测UUO模型中炎性细胞浸润情况。4.小鼠原代肾小管上皮细胞的分离与培养,与巨噬细胞共培养。检测小管上皮EMT的变化。5.流式分选出纤维化肾脏巨噬细胞,分别提取RNA,检测趋化因子受体CCR2的表达。6.构建单核细胞趋化蛋白MCP-1载体。7.利用Transwell试验检测Notch信号对巨噬细胞迁移能力的影响。8.利用染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,CHIP)检测Notch信号对CCR2的调控。【实验结果】1.成功建立小鼠UUO模型。2.在CD11C阳性细胞中敲除Notch信号,对UUO2W时的肾纤维化无显著影响。在巨噬细胞中敲除Notch信号,肾纤维化减轻(前期研究结果)。3.成功培养原代肾小管上皮细胞,巨噬细共培养试验发现,敲除巨噬细胞中Notch信号能减轻肾小管上皮细胞发生EMT,减轻肾纤维化。4.巨噬细胞敲除Notch信号后CCR2表达下降。5.巨噬细胞敲除Notch信号后,迁移能力下降,巨噬细胞过表达Notch信号后,迁移能力增强。6.Notch信号间接的调控CCR2的表达。促进巨噬细胞迁移。【结论】1.在CD11C阳性细胞中敲除Notch信号,对UUO2周时的肾纤维化无明显影响。2.Notch信号间接的调控CCR2的表达,从而使CCR2阳性的巨噬细胞向肾脏损伤处募集,从而加重肾纤维化。
【关键词】：肾纤维化 Notch信号 巨噬细胞 CCR2 CD11C
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-29
• 1 肾纤维化的发生发展16-18
• 2 免疫细胞在肾纤维化中的作用18-24
• 3 肾纤维化产生的分子机制研究24-25
• 4 Notch信号与慢性肾脏病25-29
• 第一部分 在CD11C阳性细胞中敲除Notch信号对肾纤维化的影响29-46
• 1 材料与仪器29-31
• 2 实验方法31-36
• 3 实验结果36-43
• 4 讨论43-46
• 第二部分 Notch信号调控巨噬细参与肾纤维化的机制研究46-68
• 1 材料与仪器46-49
• 2 实验方法49-58
• 3 实验结果58-66
• 4 讨论66-68
• 小结68-69
• 参考文献69-77
• 个人简历与研究成果77-78
• 致谢78-79

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本文编号：646237