胰高血糖素样肽-1对晚期氧化蛋白产物诱导足细胞凋亡的影响及机制

发布时间：2017-09-07 11:10

  本文关键词：胰高血糖素样肽-1对晚期氧化蛋白产物诱导足细胞凋亡的影响及机制

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【摘要】：[背景]随着生活水平提高,饮食结构改变,体力活动减少,糖尿病的患病率呈上升趋势。糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)作为糖尿病的严重微血管并发症,是导致患者死亡、残疾的主要原因之一。在发达国家,DN已成为终末期肾病的首要原因。在我国,糖尿病肾病为引起终末期肾病的第二原因,仅次于肾小球肾炎。终末期肾病治疗费用高,给社会带来沉重的财政负担。因此加强对早期糖尿病肾病的干预和防治,对降低终末期肾病的发病率有十分重要的临床意义和社会意义。最初研究认为系膜外基质增多和系膜增宽是糖尿病肾病的关键性病理改变,然而,这并不能完全解释尿白蛋白排泄率以及肾小球滤过率的变化。越来越多的研究证实,足细胞的损伤和凋亡在糖尿病肾病的早期发生和发展中发挥了重要作用。足细胞,即肾小球脏层上皮细胞,是一种终末分化的多突状细胞,为肾小球滤过屏障的主要组成部分。此外,足细胞还可以对抗毛细血管腔内的流体静水压,维持毛细血管腔的开放,合成基质成分以及清除肾小球囊腔的免疫复合物和其它大分子物质。糖尿病患者存在糖、蛋白质、脂肪代谢紊乱,这些代谢因素可以通过不同的途径损害肾脏。造成DN足细胞受损的可能因素有高血糖、高血压、高血脂、糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation endproducts,RAGE)上调等。近年来,调节RAGE受体上调的上游通路及其下游通路导致足细胞受损及凋亡的机制成为研究热点。RAGE是AGEs(advanced glycation end products,糖基化终末产物)的特异性受体,但并非专一受体,体内的多种氧化应激产物如AOPPs(advanced oxidative protein products,晚期氧化蛋白产物)、脂多糖、补体C3a等信号分子均可以作用于RAGE受体,介导组织和细胞的氧化应激损伤。目前,AOPPs在糖尿病肾病中的致病作用逐渐引起了广泛的关注。AOPPs是次氯酸对蛋白质氧化修饰生成的含双酪氨酸的蛋白交联物,结构和生物学作用与AGEs相似。有人研究了2型糖尿病患者血浆中AOPP的浓度与蛋白尿的关系,发现随着蛋白尿逐渐增多,体内AOPP浓度也随之逐渐增加,这提示AOPP可能参与了DN的发生发展,并且它能反映肾脏受损害的程度。另有研究表明,在糖尿病肾脏损伤早期时,若注射AOPPs,可以加重肾脏的结构损伤和功能失调。在慢性肾病患者,血液循环中的AOPPs浓度水平与肾病进展速度呈正相关。AOPPs还可以通过其受体RAGE通路激活NADPH氧化酶并促进糖尿病患者肾脏炎症反应,如诱导致炎细胞因子和黏附分子的产生。以上的研究都反映了AOPP的致炎、致氧化应激作用,并表明了AOPPs的慢性蓄积加剧了肾脏的炎症反应,且促进了DN的进展。Zhou LL等发现AOPPs可以导致小鼠来源的足细胞凋亡率明显增加,且在一定范围内,足细胞的凋亡率与AOPPs作用的浓度和时间呈依赖性增加,在AOPPs浓度为200ug/ml,作用时间为48小时的条件下,足细胞凋亡率发生最高。同时,体内实验发现足细胞的凋亡与蛋白尿的出现同步,并且均发生在明显的足细胞数量缺失之前,这提示足细胞的凋亡有可能是DN发病进展的早期形式。研究还发现,AOPPs诱导的足细胞凋亡主要是通过激活NADPH氧化酶,从而增加细胞内活性氧的产生,同时上调了p53、Bax、 caspase3的活性来实现的。在2012年,该研究团队又分别从体内和体外实验来证实AOPPs-RAGE通路介导了足细胞的凋亡,AOPP经PKC途径激活NADPH氧化酶,使细胞内超氧化物过表达,并且依次促进p53/Bax/caspase依赖的经典凋亡途径诱导足细胞发生凋亡,反过来,通过加用RAGE抑制剂可以明显阻断AOPPs诱导的足细胞凋亡。这些研究提示：AOPPs-RAGE通路的活化是各种生化和分子转导信号的共同途径并最终导致组织炎症蔓延和细胞功能紊乱的这一假说。越来越多研究发现GLP-1 (glucagon-like peptide-1,胰高血糖素样肽-1)在脐静脉内皮细胞、胰岛细胞、心肌细胞、视网膜细胞等可拮抗AGEs或AOPPs的致炎症、致氧化应激作用。GLP-1是由肠道L细胞分泌的一种重要的肠肽激素,可通过其受体作用于胰岛β细胞促进胰岛素分泌,同时还可以促进p细胞增殖和抑制p细胞凋亡,目前已广泛应用于临床2型糖尿病的治疗。研究表明,GLP-1除了可以促进p细胞增殖、抑制p细胞凋亡,促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素释放等作用外,还具有确切的心血管保护作用,此外,体内外研究均证实,GLP-1对心脏、大脑、肾脏等器官及其细胞和组织具有保护作用。最新的研究证实,GLP-1在多种细胞中均可减弱AGEs-RAGE-氧化应激轴,防止细胞凋亡。Ishibashi等研究发现GLP-1可以通过GLP-1受体直接作用于肾脏系膜细胞,激活cAMP通路而减少RAGE的表达,降低活性氧簇的产生,最终减轻AGEs-RAGE诱导的炎症反应对肾脏的损害。Oeseburg H等发现GLP-1能减轻Zucker糖尿病肥胖大鼠氧化应激反应；此后Puddu A等在胰腺p细胞HIT-T15中也发现GLP-1减弱AGEs诱导的RAGE表达,抵抗AGEs-RAGE通路AGEs诱导的细胞凋亡和坏死。探讨减少足细胞的早期损伤和凋亡作用因素和机制,将为临床糖尿病肾病的早期干预提供新的思路和策略。本研究以AOPPs诱导足细胞凋亡为研究模型,探讨GLP-1干预对足细胞凋亡的影响及其相关机制,以期为拓展GLP-1的肾脏保护作用提供实验基础。[目的]本课题拟在以AOPPs诱导足细胞凋亡为研究模型的基础上,通过观察GLP-1干预对AOPPs诱导足细胞凋亡的影响,同时检测其对细胞凋亡相关蛋白及对AOPPs-RAGE通路的影响,初步探讨GLP-1对AOPPs诱导足细胞凋亡的影响及分子机制。[内容]课题分为以下两大部分：第一部分GLP-1对AOPPs诱导足细胞凋亡的影响目的以AOPPs诱导足细胞凋亡为研究模型,观测GLP-1干预对AOPPs诱导足细胞凋亡的影响。方法1.体外制备、鉴定AOPP将20 mg/ml小鼠血清白蛋白(RSA)与等体积的40 mmol/1次氯酸混合,放置30min,制备出RSA与次氯酸摩尔比为1：140的AOPP。制备的AOPP经由无内毒素PBS透析24h,除去过多游离的次氯酸。用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后4℃保存。20 mg/ml RSA与PBS等体积混合,作为对照。以荧光分光光度计鉴定AOPP。2.培养足细胞增殖期：33℃孵箱培养。在重组小鼠γ-干扰素诱导下增生,待其长至约85%,使用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化细胞后传代。分化期：待细胞长至30-40%时,用不含IFN-y的培养基转入37℃孵箱继续培养,每周换液2-3次,约培养10-14天。目标：长出足突,最好长出二级足突。3.CCK8法测定细胞的活力实验分组：200μg/mLAOPPs与不同浓度GLP-1(0、10、50、100、200 nmol/L)共同作用足细胞48h。将上述各组细胞按每孔5×104个细胞的密度种于96孔板的玻片上,待达到70%-90%融合时收集细胞。每孔加入10μl CCK-8试剂,继续培养2h。在酶联免疫检测仪OD450nm处测量各孔的吸光值。同时设置空白孔和对照孔。细胞存活率=(测定组OD值-空白组OD值)／(对照组OD值-空白组OD值)。4. Hoechst33258荧光染色观察各组足细胞形态学变化5.流式细胞仪检测分析足细胞凋亡率实验共分为4组,依次为阴性对照RSA组、200μg/mLAOPPs、100 nmol/LGLP-1组、200μg/mLAOPPs+100 nmol/LGLP-1组,作用足细胞48h后,收集各组细胞,离心,弃上清,PBS液清洗二次,均匀吹散沉淀细胞,加入Annexin V和碘化丙啶(P1),避光放置15min,于流式细胞仪上样检测,软件分析细胞凋亡率。统计学处理采用SPSS 20.0进行统计分析,实验数据属计量资料,则以均数±标准差(x±s)表示,采用单向方差分析(One-Way ANOVA)检验,两两比较采用LSD法。相关分析采用Spearman相关分析法。P0.050,具有统计学意义。结果1.研究不同浓度GLP-1 (0、10、50、100、200 nmol/L)拮抗200μg/mL AOPPs对足细胞的活性影响AOPPs组的OD值为0.10±0.02,与阴性对照组(0.35±0.02)相比,有显著差异(P=0.000)。AOPPs+GLP-1组在10、50、100、200 nmol/L GLP-1四种不同浓度下的的OD值依次为0.11±0.01、0.16±0.02、0.21±0.03、0.23±0.02,分别与AOPPs组相比较,除了AOPPs+1 Onmol/LGLP-1组的OD值与AOPPs组相比,无显著差异之外(P=0.932),50、100、200 nmol/L GLP-1三组OD值均显著高于AOPPs组(AOPPs组vs.50 nmol/LGLP-1+AOPPs组,P= 0.036; vs.100、200 nmol/LGLP-1+AOPPs组,P=0.000)。AOPPs组和四个不同浓度的AOPPs+GLP-1组的OD值均显著低于对照组(P=0.000)。经Spearman相关分析发现,GLP-1浓度(10、50、100、200 nmol/L)与足细胞的OD值间存在显著正相关关系(r=0.901,P=0.000)。2.细胞形态学变化药物干预各组足细胞48h后,Hoechst33258染色,于荧光显微镜下观察：可见阴性对照组足细胞细胞核染色质呈均匀荧光；AOPPs组的细胞核固缩,核致密浓染或裂解呈碎块状,核染色质边集；AOPPs+GLP-1细胞核浓染、固缩及核碎裂的细胞较AOPPs组明显减少。3.流式细胞术检测细胞早期凋亡率各组细胞经药物作用48h后,AOPPs组的足细胞总凋亡率为(26.78±2.58)%,显著高于阴性对照组(7.27±0.55)%(P=0.000),同时亦显著高于AOPPs+GLP-1组(14.43±0.93)%(P=0.001)。结论GLP-1在一定的浓度范围(50～200 nmol/L)内有拮抗AOPPs抑制足细胞活性的作用,而且可部分减少AOPPs诱导的足细胞凋亡。第二部分GLP-1抑制AOPPs诱导足细胞凋亡的机制第一节GLP-1对AOPPs诱导足细胞的氧化应激caspase家族主要酶的影响目的通过激光共聚焦检测足细胞氧化应激水平,并采用酶联反应法检测caspase-9、-3酶活性,探讨GLP-1在足细胞发挥抗凋亡作用的可能机制。方法1.激光共聚焦检测活性氧(ROS)在处理好的足细胞中加入DCFH2DA荧光探针(用无血清培养基以1：1000稀释)对细胞内ROS进行荧光标记,在37℃含5%CO2的培养箱中孵育30min,弃去培养液,PBS液清洗3次,在荧光显微镜下观察各组中细胞内荧光强度。2. ELISA法检测细胞凋亡蛋白酶caspase-9、-3酶活性各组细胞孵育48h,消化、离心后、用细胞裂解液重悬,再加入对应的反应底物。37℃水浴2h后,加样至96孔培养板,最后用酶联免疫检测仪测OD值,检测波长为405 nm。统计学处理采用SPSS20.0进行统计分析,实验数据属计量资料,以均数±标准差(x±s)表示,采用单向方差分析(One-Way ANOVA)检验,两两比较采用LSD法。P0.050,具有统计学意义。结果1.GLP-1抑制AOPPs诱导细胞内ROS生成足细胞阴性对照组的荧光值为30.58±2.06。AOPPs作用48h后细胞的荧光值为64.60±2.91,显著高于对照组(P=0.000)。AOPPs+GLP-1组的荧光值为48.93±2.99,显著低于AOPPs组(P=0.000),仍高于对照组(P=0.000)。2.GLP-1对AOPPs诱导caspase-9、-3的活性的影响各组细胞干预48h后,AOPPs组的caspase-3、-9显著高于各自的RSA对照组(P=0.000,0.000)和AOPPs+GLP-1组(P=0.000,0.000)。结论AOPPs作用于足细胞48h后,细胞内ROS水平升高,凋亡蛋白酶caspase-9、-3的活性增加,GLP-1可部分减少AOPPs诱导的这些效应。第二节Exendin 9-39对AOPPs诱导的RAGE信号通路的影响目的研究GLP-1受体抑制剂Exendin 9-39对AOPPs-RAGE信号通路及其下游Bcl-2、Bax蛋白表达的影响,进一步探讨GLP-1减轻AOPPs所致足细胞凋亡的分子机制。方法1.实验共分为4组,分别为阴性对照组、200μg/mLAOPPs、 200μg/mLAOPPs+100 nmol/LGLP-1组、200μg/mLAOPPs+100 nmol/LGLP-1组±GLP-1受体抑制剂(exentin9-39),作用足细胞48h。2.Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡(余同第一章)3.qPCR测RAGE mRNA细胞使用胰酶进行消化,以1×105个/mL接种于培养皿内,培养24h,吸去培养基,干预结束后,Trizol提取总RNA,并采用紫外分光光度计进行RNA含量的检测,根据RT-PCR试剂盒进行操作,使用荧光定量PCR法进行基因相对表达量的检测。4. Western blotting法检测细胞RAGE、Bcl-2、Bax蛋白的表达收集各组细胞,根据蛋白提取试剂盒操作,分别提取各组细胞总蛋白及核蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度。每组蛋白质样本20μg,以12% SDS-PAOPP进行电泳,转膜后5%脱脂奶粉封闭2h,洗膜后加入RSA-TBS稀释的抗RAGE抗体、抗Bcl-2单克隆抗体(1：1000),抗Bax(1：2000)单克隆抗体,4℃孵育过夜,再次洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1：5000)杂交1h,洗膜后显色,结果用Image J分析软件对目的条带进行灰度值分析。统计学处理采用SPSS 20.0进行统计分析,计量实验数据以均数±标准差(i±s)表示,采用单向方差分析(One-Way ANOVA)检验,两两比较采用LSD法。P0.050具有统计学意义。结果1.不同浓度GLP-1对AOPPs上调足细胞RAGE基因和蛋白表达水平的影响按实验分组施加不同干预后,RT-PCR测定各组足细胞的RAGE mRNA含量,AOPPs组RAGE mRNA表达量(8.59±3.10),显著高于阴性对照组(2.17±0.63,P=0.000), AOPPs+(50、100、200 nmol/L)GLP-1组作用于足细胞48h后,RAGE mRNA含量分别为2.87±1.00,1.98±0.35,1.00±0.22,均显著低于AOPPs组(8.59±3.10,P=0.000),50nmol/L组的RAGE mRNA含量高于100nmol/L组(P=0.022),而100 nmol/L组的RAGE mRNA亦高于200 nmol/L (P=0.001)。同样干预后,Western blot检测GLP-1对足细胞RAGE蛋白表达水平。AOPPs组的RAGE蛋白灰度值校正值为1.04±0.02,显著高于RSA对照组(0.14±0.01,P=0.000)相比。AOPPs+(10、50、100、200nmol/L) GLP-1组的RAGE蛋白灰度值校正值依次为0.72±0.05,0.35±0.01,0.24±0.01,均显著低于AOPPs组(P=0.000)。50 nmol/L组的RAGE蛋白表达量高于100 nmol/L组(P=0.022),而100 nmol/L组的RAGE蛋白表达量亦高于200 nmol/L (P=0.001).2. exendin9-39对GLP-1拮抗AOPPs诱导细胞凋亡的影响各组细胞经干预作用48h后,AOPPs组的总凋亡细胞百分率为(27.57±1.11)%,显著高于对照组(6.55±0.31)%(P=0.000),同时亦显著高于AOPPs+GLP-1组(9.53±0.64)%(P=0.002)。exendin9-39预处理组的凋亡率为(18.41±1.16)%,显著高于AOPPs+GLP-1组(P=0.000)。3. exendin9-39对GLP-1与AOPPs干预下足细胞的Bcl-2、Bax、RAGE蛋白表达的影响各组细胞经作用48h后,AOPPs组Bax、RAGE蛋白表达量显著高于对照组(P=0.006,0.000), Bcl-2蛋白表达低于对照组(P=0.000),故Bcl-2/Bax比值显著低于对照组(P=0.000)。AOPPs+GLP-1组足细胞的Bcl-2蛋白表达水平明显高于AOPPs单独处理组(P=0.001),而Bax和RAGE水平显著低于AOPPs组(P=0.014,0.002),exendin9-39减弱了GLP-1抑制Bax和RAGE升高的作用(P=0.004,0.000 vs. AOPPs+GLP-1组),同时削弱了GLP-1促进Bcl-2蛋白表达增加的作用(vs. AOPPs+GLP-1组,P=0.001)。结论RAGE受体的下调可能参与了GLP-1改善AOPPs诱导的足细胞凋亡作用；GLP-1可以增加AOPPs诱导的足细胞凋亡过程中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,而减少促凋亡蛋白Bax的表达。
【关键词】：胰高血糖素样肽-1 晚期氧化蛋白产物 足细胞 凋亡
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2;R692.9
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-22
• 前言22-31
• 参考文献27-31
• 第一部分 胰高血糖素样肽-1对晚期氧化蛋白产物诱导足细胞凋亡的影响31-48
• 1. 材料与方法32-38
• 2. 结果38-42
• 3. 讨论42-44
• 4. 小结44
• 参考文献44-48
• 第二部分 GLP-1抑制AOPPs诱导足细胞凋亡的机制48-77
• 第一节 GLP-1对AOPPs诱导足细胞的氧化应激和caspase家族主要酶的影响48-58
• 1. 材料与方法48-49
• 2. 实验方法49-51
• 3. 结果51-52
• 4. 讨论52-55
• 5. 小结55
• 参考文献55-58
• 第二节 GLP-1对AOPPs诱导的RAGE信号通路的影响58-77
• 1. 材料与方法58-64
• 2. 结果64-72
• 3. 讨论72-74
• 4. 小结74
• 参考文献74-77
• 结论77-78
• 中英文缩略词表78-79
• 攻读学位期间成果79-80
• 致谢80-81

【共引文献】

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本文编号：809186