肾缺血再灌注损伤中miRNA表达谱筛选及miR-98调控HUVEC凋亡的作用

发布时间：2017-09-19 10:53

  本文关键词：肾缺血再灌注损伤中miRNA表达谱筛选及miR-98调控HUVEC凋亡的作用

  更多相关文章： microRNA 缺血再灌注损伤 急性肾损伤 生物标记物 microRNA 缺血再灌注损伤 微血管内皮细胞 caspase-3

【摘要】：第一部分大鼠肾脏缺血再灌注损伤时miRNA表达谱的筛查[研究目的]通过基因芯片筛选大鼠肾脏缺血再灌注损伤后miRNAs表达谱的变化并分析。[研究方法]1、构建SD大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型：大鼠经适应性饲养1周后,禁食约12h,腹腔麻醉并消毒后,经腹正中线切开皮肤、腹膜,充分暴露双侧肾蒂,使用无创微型血管夹迅速夹闭双侧肾蒂,伤口覆盖盐水纱布,恒温灯保持腹部体温,45mmin后同时松开血管夹,缝合腹膜和皮肤。大鼠造模12h后,再次麻醉大鼠,收集标本。2、实验分组：10周龄大鼠12只随机分为两组,每组6只：①实验组：双侧肾脏血管夹夹闭45分钟后再灌注12小时后收集标本；②假手术组：同样的方法游离暴露双侧肾蒂,直接覆盖盐水纱布后等待45mmin,12h后逐层缝合切口。3、标本收集和检测方法：心脏穿刺取血,检测血清肌酐与尿素氮,同时取肾脏利用microRNA芯片技术检测肾脏缺血再灌注时miRNA的表达变化,最后通过RT-PCR验证芯片检测结果。[结果]1、成功构建大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型,缺血再灌注损伤后血清肌酐和尿素氮水平明显升高。2、通过microRNAs芯片结果观察到大鼠肾脏缺血再灌注损伤后36条miRNAs出现明显的表达变化,其中有15条miRNAs表达差异超过两倍。通过RT-PCR验证与miRNAs芯片结果一致,其中10条miRNAs表达上调,5条miRNA表达下调,表达上调的分别是：miR-98、miR-196a、miR-146b、miR-292-5p、 miR-132、miR-327、miR-374、miR-290、miR-352、和miR-894,下调的miRNA是：miR-145、miR-29a、miR-329、miR-140和miR-375。[结论]大鼠肾脏缺血再灌注损伤时miRNA表达谱发生明显变化,可能通过炎症激活、细胞凋亡与增殖、血管形成和间质纤维化等参与肾脏缺血再灌注损伤的发生与发展,具体机制有待进一步研究证实。第二部分缺氧复氧损伤时HUVEC中miR-98的表达变化及其通过靶基因Caspase-3对细胞凋亡的调控[研究目的]体外探讨微血管内皮细胞在缺氧复氧损伤后miR-98表达水平的变化及其对细胞凋亡的影响,并探讨可能的机制。[研究方法]1、培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC),构建体外的缺氧复氧模型,通过轻质石蜡油覆盖细胞表面模拟缺血刺激。60min后,加入无血清无糖DMEM培养基培养24h。在不同时间点收集细胞,用RT-PCR法检测检测miR-98的表达。2、HUVEC转染miR-98 inhibitor和Mimics及相应的对照,抑制或过表达miRNA;在缺氧复氧模型,在mRNA水平和蛋白质水平检测潜在靶基因caspase-3的表达变化,流式细胞仪和TUNEL检测细胞凋亡情况。3、通过生物信息学检索,明确miR-98和caspase-3的3'端UTR区的碱基互补序列。并构建3UTR (Casp3)报告基因载体和3UTR (Casp3) mut报告基因载体。目的基因3'UTR区域构建至载体中报告基因萤光素酶的后面,通过比较过表达miRNA后,报告基因表达的改变定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。[结果]1、HUVEC缺氧复氧后miR-98表达4h即出现上升；24h时表达升至对照组5倍。2、体外转染miR-98 inhibitor后,发现Caspase-3与miR-98之间存在明显的负相关现象。3、成功构建3UTR(Casp3)报告基因载体和3UTR(Casp3) mut报告基因载体(突变模式为CTACCTCA突变为AACAUCGA; miR-98可调节CASP3 3'UTR的luciferase的表达(p0.0001)。[结论]1、HUVEC缺氧复氧损伤后出现miR-98的表达上升。2、miR-98的表达对IRI损伤后HUVEC中capase-3和细胞凋亡有负向调节作用。说明miR-98可对缺氧复氧损伤后的微血管内皮细胞产生一定的保护作用。3、Caspase-3为miR-98的靶基因。
【关键词】：microRNA 缺血再灌注损伤 急性肾损伤 生物标记物 microRNA 缺血再灌注损伤 微血管内皮细胞 caspase-3
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 主要英文缩略词12-14
• 前言14-16
• 第一部分 大鼠肾脏缺血再灌注损伤时miRNAs表达谱的筛查16-27
• 材料和方法16-21
• 统计学分析与处理21-22
• 结果22-25
• 讨论25-26
• 小结26-27
• 第二部分 缺氧复氧损伤时HUVEC中miR-98的表达变化及其通过靶基因Caspase-3对细胞凋亡的调控27-48
• 材料和方法27-36
• 统计学分析与处理36-37
• 结果37-45
• 讨论45-48
• 全文总结48
• 主要结论48-49
• 综述49-56
• 参考文献56-64
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况64-65
• 致谢65

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本文编号：881227