脑肠肽对肾间质纤维化疗效及作用机制的研究

发布时间：2017-09-23 18:22

  本文关键词：脑肠肽对肾间质纤维化疗效及作用机制的研究

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【摘要】：第一章脑肠肽对UUO大鼠肾间质纤维化影响及机制研究背景：肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis, RIF)是由多种原因引起的细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)过渡沉积,并最终导致肾脏纤维形成和功能丧失,是多种慢性肾脏疾病(Chronic kidney disease, CKD)进展至终末期肾病的最后共同通路,也是导致终末期肾功能衰竭的主要病理基础。目前针对终末期肾衰竭只能实施腹膜透析、血液透析和肾脏移植等替代疗法,而透析治疗的并发症多、患者的生活质量不高；肾脏移植又存在供体短缺及肾移植术后相关并发症等问题,因此及早干预甚至逆转肾脏纤维化对于防治终末期肾衰竭具有重要意义。脑肠肽是由28个氨基酸残基组成的胃肠激素,主要由胃底黏膜的泌酸腺X/A样细胞合成并分泌。脑肠肽作为促生长激素释放激素内源性配体,能明显促进生长激素的分泌,并具有调控能量代谢及胃肠功能的作用。近年来大量的研究表明脑肠肽还具有减轻炎症反应和抗纤维化的作用。脑肠肽在多种类型的动物纤维化模型和体外实验中均能发挥较强的抗纤维化作用。在肾脏缺血再灌注模型中,脑肠肽能减轻炎症反应,减少细胞凋亡,改善肾脏功能,但脑肠肽在肾脏纤维化模型中的作用机制尚不明确。目的：观察脑肠肽对单侧输尿管结扎(Unilateral ureteral obstruction, UUO)大鼠肾间质纤维化动物模型RIF及相关纤维化因子表达的影响；进而探讨脑肠肽抗肾脏纤维化的作用机制。实验方法：1、实验分组及模型制作将雄性SD大鼠(40只)随机分为4组：假手术组(Sham+Vehicle),假手术组+脑肠肽治疗组(Sham+Ghrelin),模型组(UUO+Vehicle),脑肠肽治疗组(UUO+Ghrelin)。模型组及脑肠肽治疗组行左侧输尿管结扎制成大鼠UUO模型。而假手术组大鼠仅分离左侧输尿管,不进行结扎,麻醉及其余手术步骤与模型组相同。术后14天处死大鼠,收集肾脏标本进行相应实验指标检测。2、Masson染色按常规方法行Masson染色。取Masson染色切片,每例切片高倍镜下(x200)观察10个互不重叠肾小管间质视野,荧光显微镜下观察、拍照、分析。3、肾脏组织石蜡切片制作大鼠麻醉后,分别用生理盐水和4%多聚甲醛溶液经心脏灌注。梗阻侧肾脏组织,于4%多聚甲醛溶液中浸泡24小时后,按照常规石蜡包埋法制成石蜡标本并切片,切片厚度为3μm,捞片、风干后备用。4、免疫组化组织切片经脱蜡、水化,在柠檬酸缓冲液(0.01 mol/L)中给予微波热修复30min。适度冷却后依次给予0.3%过氧化氢溶液、山羊血清、一抗、生物素化二抗和辣根酶标记链霉卵白素工作液封闭和孵育。DAB显色液显色,中性树胶封片后在显微镜下观察并拍照。5、免疫荧光石蜡切片脱蜡至水,在Tris-EDTA (PH8.5)或柠檬酸缓冲液(0.01 mol/L)中给予微波热修复,血清封闭后滴加一抗,4℃孵育12-24h,PBS溶液洗涤后滴加相应荧光二抗,37℃孵育1h。荧光显微镜下观察、拍照、分析。6、Western Blot方法检测蛋白表达变化大鼠麻醉后处死,取梗阻侧肾脏组织约1OOmg,液氮中保存备用。组织标本经匀浆、裂解、离心(12000rpm,5℃,10min)后,蛋白浓度检测试剂盒测定总蛋白浓度。蛋白裂解液依次经过电泳、转膜、一抗及二抗孵育、显影及定影。凝胶成像系统扫描并分析α-SMA、E-cadherin、FN、col-Ⅰ、col-Ⅲ、TGF-β1、 p-Smad3蛋白表达变化。7、统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计学分析,计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示,组间比较采用ONE-WAY方差分析,多重比较用LSD-t检验,以P0.05为差异有统计学意义。结果：(1) Masson染色结果显示UUO术后14天模型组大鼠梗阻侧肾组织见明显间质纤维化病理改变；与模型组相比,脑肠肽治疗组RIF面积明显减少。免疫组化结果显示UUO术后14天模型组大鼠梗阻侧肾脏可见大量FN, col-Ⅰ蛋白表达；而脑肠肽治疗组大鼠梗阻侧肾脏FN, col-Ⅰ, col-Ⅲ蛋白明显下降。(2)WB结果显示UUO术后14天模型组大鼠梗阻侧肾脏TGF-β1, p-Smad3表达明显增多；脑肠肽干预组TGF-β1, p-Smad3表达则较前明显下降。TGF-β1免疫组化染色结果与WB结果相似。(3)免疫组化结果显示UUO术后14天模型组大鼠梗阻侧肾脏α-SMA, E-cadherin, FN的表达增多,E-cadherin的表达减少；脑肠肽干预后α-SMA, FN的表达明显下降,E-cadherin无明显下降。WB的结果同样证实脑肠肽治疗组大鼠梗阻侧肾脏α-SMA, FN的表达下降,而E-cadherin的表达无明显下降。结论：(1)脑肠肽具有抗肾间质纤维化作用。(2)脑肠肽能通过阻断TGF-β1/Smad3信号通路,从而抑制肾间质纤维化。(3)脑肠肽能够通过抑制肾小管上皮间质转分化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)过程,从而抑制肾间质纤维化。第二章脑肠肽对纤维化炎症反应的影响及机制研究背景：炎症反应是RIF的始动环节之一,在纤维化过程中具有非常重要的作用。炎症细胞侵润是早期肾脏损伤的重要病理表现,炎症反应的迁延和持续,最终促进肾间质纤维化的形成和肾脏失功。炎症细胞侵润在肾脏纤维化过程中发挥着重要作用,而趋化因子和炎症因子的释放是炎症细胞侵润和炎症反应持续的关键因素。大量研究表明脑肠肽能够通过抑制炎症细胞侵润、炎性因子的释放以及实质细胞凋亡,在炎症性肠病、急性胰腺炎、脓毒血症、内风湿性关节炎、强直性脊柱炎等急慢性炎症反应性疾病中发挥重要的抗炎及治疗作用。在大鼠肾脏缺血再灌注模型中,脑肠肽能减轻受损肾脏炎症反应,减少细胞凋亡,改善肾脏功能。目的：观察脑肠肽对UUO大鼠肾组织炎症细胞侵润,炎症因子、趋化因子表达和对肾小管上皮细胞凋亡的影响；探讨脑肠肽抗肾脏炎症及肾间质纤维化的作用机制。方法：1、实验分组及模型制作将雄性SD大鼠(40只)随机分为4组：假手术组(Sham+Vehicle),假手术组+脑肠肽治疗组(Sham+Ghrelin),模型组(UUO+Vehicle),脑肠肽治疗组(UUO+Ghrelin)。模型组及脑肠肽治疗组行左侧输尿管结扎制成大鼠UUO模型。而假手术组大鼠仅分离左侧输尿管,不进行结扎,麻醉及其余手术步骤与模型组相同。术后7天处死大鼠,收集肾脏标本进行相应实验指标检测。2、肾脏组织石蜡切片制作(实验方法同前)3、免疫组化(实验方法同前)4、Western Blot方法检测蛋白表达变化(实验方法同前)5、TUNEL染色应用TUNEL方法,按照In Situ Cell Death Detection Kit (Roche)的步奏进行,苏木精复染核,梯度乙醇脱水,中性树胶封片。每张切片高倍镜下(x 400)依次观察肾间质区域20个不重叠视野,计数TUNEL阳性的细胞数。6、Real-time PCRRT-PCR Trizol法提取组织RNA,并进行质检,质检合格后逆转录法合成cDNA,并通过Prime5.0进行引物序列设计。IL-1p上游引物：5'-CCT CTG ACA GGC AAC CAC TTA-3'; MCP-1上游引物:5'-GTG TCC CAA AGA AGC TGT AGTATT-3',下游引物：5'-GTG CTG AAG TCC TTA GGG TGA-31; TNF-α上游引物：5'-GTC GTA GCA AAC CAC CAA GCC-31,下游引物：5'-CTC CTG GTA TGA AAT GGC AAA-3'。按照按SYBRpremixExTa说明书进行反应,实时荧光定量利用PCR技术通过2-ΔΔCT方法分析相对基因表达差异数据分析。GAPDH作为内参。7、统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计学分析,计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示,组间比较采用ONE-WAY方差分析,多重比较用LSD-t检验。以P0.05为差异有统计学意义。结果：(1)免疫组化结果显示UUO术后7天模型组大鼠梗阻侧肾脏可见大量炎症细胞侵润；脑肠肽治疗组间质炎症细胞侵润明显减少。(2)UUO术后7天模型组大鼠梗阻侧肾脏炎症及趋化因子(IL-1β、MCP1、 TNF-α) mRNA的表达水平明显升高；脑肠肽治疗组炎症及趋化因子mRNA的表达水平显著下降。(3)UUO术后7天模型组大鼠梗阻侧肾脏p-p65表达水平明显增高；脑肠肽治疗组p-p65表达水平显著下降。(4) TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)染色结果显示UUO术后7天模型组大鼠梗阻侧肾脏肾小管上皮细胞(Tubular epithelial cells, TECs)凋亡细胞明显增多；脑肠肽治疗组凋亡细胞的数量明显减少。结论：(1)脑肠肽能够通过抑制炎症及趋化因子的表达,从而抑制炎症细胞侵润,进而有效减轻梗阻侧肾脏的炎症反应。(2)脑肠肽能通过减少肾TECs凋亡,进而减轻肾脏损伤。
【关键词】：肾脏 输尿管梗阻 脑肠肽 炎症 纤维化
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 第一章 脑肠肽对UUO大鼠肾间质纤维化影响及机制19-54
• 1 前言19-22
• 2 实验材料22-26
• 3 实验方法26-36
• 4 统计学方法36
• 5 结果36-49
• 6 讨论49-53
• 7 结论53-54
• 第二章 脑肠肽对纤维化炎症反应的影响及机制54-74
• 1 前言54-55
• 2 实验材料55-58
• 3 实验方法58-66
• 4 统计学方法66
• 5 结果66-71
• 6 讨论71-73
• 7 结论73-74
• 参考文献74-81
• 英文对照与缩略词表81-83
• 成果83-84
• 致谢84-85

【共引文献】

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1 刘聪;李蓉;;Ghrelin与炎症性疾病的研究进展[J];重庆医学;2014年04期

2 刘聪;李宏;李蓉;粟永萍;;Ghrelin对放烧复合伤大鼠的救治作用[J];第三军医大学学报;2014年03期

3 张钦;杨晓慧;唐天驷;;生长激素释放肽对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的保护作用[J];广东医学;2015年19期

4 王向红;杨梅花;冯忠军;卢亚敏;;类风湿性关节炎患者血清和关节滑液中Ghrelin水平的变化比较[J];河北医药;2013年22期

5 陈峤;黄健;黄显凯;;乌司他丁联合ghrelin对内毒素血症大鼠肠功能障碍的影响[J];局解手术学杂志;2014年01期

6 元艳;方静;廖婷彬;崔雪;陈s，

本文编号：906800