胰岛素样生长因子2对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化和葡萄糖摄取的影响

发布时间：2017-10-11 13:32

  本文关键词：胰岛素样生长因子2对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化和葡萄糖摄取的影响

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【摘要】：目的:胰岛素样生长因子2(IGF2)是在细胞分裂时广泛表达的多肽激素。尽管胰岛素样生长因子在血清中丰富存在,但与胰岛素和胰岛素样生长因子1(IGF1)比较,对于IGF2的生理及病理作用的研究是有限的。IGF2调节胎儿的生长和分化,但在成人中的作用知之甚少。有证据表明IGF2主要在骨骼肌、脂肪组织、骨骼和卵巢中发挥作用。IGF2表达的改变可在代谢状态、肥胖、糖尿病和多囊卵巢综合征中观察到。本研究拟观察IGF2对前脂肪细胞3T3-L1增殖、分化以及对葡萄糖摄取功能的影响,并初步探讨其影响3T3-L1作用的可能分子机制。方法:①用ELISA试剂盒检测社区代谢综合征患者和非代谢综合征对照人群血清样本以及实时荧光定量qPCR检测高脂喂养肥胖模型小鼠和普通喂养对照小鼠不同组织样本中IGF2的表达情况。②培养 3T3-L1 前脂肪细胞,按 Ong/m1、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml 的 IGF2浓度梯度进行干预,以Promega公司的CellTiter 96(?)AQueous单溶液检测系统(MTS)检测细胞增殖能力。③ 培养3T3-L1前脂肪细胞,按不同浓度梯度IGF2进行干预,用Annexin V-FITC法及Hoechst33258染色法检测不同浓度IGF2对3T3-L1细胞凋亡能力的影响。④采用含胰岛素、地塞米松与IBMX的分化培养基诱导分化3T3-L1细胞,并用不同浓度的IGF2进行细胞处理,用油红O染色法分析脂肪细胞的分化程度。⑤分别采用荧光显微镜和流式细胞仪定量检测平均荧光强度观察不同浓度IGF2对3T3-L1诱导分化细胞对于荧光标记2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)的摄取能力。⑥利用实时荧光定量qRT-PCR的方法对不同浓度IGF2处理诱导分化3T3-L1细胞后维持分化相关转录因子(PPARy、CEBPβ等)、脂代谢关键酶(LPL、FAS等)及脂因子(Leptin、Adiponectin等)基因mRNA表达水平进行检测,利用Western Blot方法检测经典胰岛素信号通路Akt及p-Akt蛋白的表达变化,以寻找IGF2影响3T3-L1细胞增殖分化的可能调控基因。结果:①社区代谢综合征患者血清中IGF2表达水平较非代谢综合征对照人群显著升高;IGF2在正常小鼠肌肉及脂肪来源的组织中存在较高水平表达;成功构建高脂喂养肥胖模型小鼠,显示IGF2在肥胖小鼠白色脂肪组织中表达较普通喂养对照小鼠升高;②用不同浓度梯度的IGF2(0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)分别处理前脂肪细胞3T3-L1后,用MTS系统检测细胞增殖能力,发现随着IGF2作用时间的延长和使用浓度的升高,MTS在490nm处的吸光度呈上升趋势,提示其增殖能力增强;③不同浓度梯度IGF2干预3T3-L1细胞后,分别用Annexin V-FITC法及Hoechst33258染色法检测发现IGF2对3T3-L1细胞凋亡能力无明显影响;④ 采用传统鸡尾酒法白色诱导分化3T3-L1细胞后,用不同浓度的IGF2进行细胞处理,用油红O染色法分析脂肪细胞的分化程度显示高浓度的IGF2可以增加3T3-L1细胞的分化程度,100ng/ml浓度IGF2处理组细胞的体积大小和脂滴形态较对照组(0ng/ml)大;⑤无论是流式细胞仪的定量检测还是荧光显微镜的拍摄,结果都显示随着IGF2处理浓度的升高,3T3-L1诱导分化细胞对葡萄糖的摄取增加(与0ng/mlIGF2对照组相比,10ng/ml、50ng/ml、100ng/mlIGF2组荧光强度分别增加11.6%、22%、24.8%);⑥实时荧光定量qRT-PCR检测显示IGF2处理诱导分化3T3-L1细胞后PPARγ、PGC1α、LPL等基因mRNA水平表达上调,而Leptin表达却有一定程度下降;Western Blot方法检测则发现随着IGF2处理浓度升高,经典胰岛素信号通路中p-Akt蛋白表达升高。结论:IGF2在社区代谢综合征患者血清样本中较非代谢综合征对照人群高表达,且在高脂喂养肥胖模型小鼠白色脂肪组织中较普通喂养对照小鼠高表达。IGF2可呈时间和浓度梯度促进3T3-L1前脂肪细胞的增殖和分化,但不影响其凋亡;随着IGF2处理浓度的升高,3T3-L1细胞对葡萄糖的摄取能力增加,其机制可能是通过调控糖脂代谢及分化相关基因的表达引起,同时影响下游经典胰岛素信号通路。
【关键词】：胰岛素样生长因子2 3T3-L1前脂肪细胞 增殖 分化 葡萄糖摄取
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R58
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 缩略词表12-14
• 1 前言14-16
• 2 材料和方法16-37
• 2.1 实验材料16-20
• 2.2 溶液配置20-22
• 2.3 实验方法22-37
• 3 结果37-51
• 3.1 IGF2的表达谱分析37-41
• 3.2 IGF2促进3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化41-46
• 3.3 IGF2增加3T3-L1诱导分化脂肪细胞葡萄糖摄取46-48
• 3.4 IGF2对糖脂代谢相关基因表达变化及胰岛素信号通路的影响48-51
• 4 讨论51-54
• 5 总结54-55
• 6 展望55-56
• 7 参考文献56-59
• 综述 胰岛素样生长因子-2:在代谢和内分泌疾病中的作用59-76
• 参考文献69-76
• 作者简介76
• 攻读学位期间发表的论文76

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本文编号：1012805