葡萄糖激酶激活剂HMS5552对2型糖尿病大鼠肝组织中葡萄糖激酶的调节作用

发布时间：2021-03-08 13:53

目的:观察葡萄糖激酶激活剂(HMS5552)对2型糖尿病大鼠肝组织中葡萄糖激酶的调节作用及可能作用机制。方法:采用高脂高糖饲料喂养和一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ 40mg/Kg)的方法诱导2型糖尿病动物模型。从60只健康SD大鼠中随机挑出10只作为正常组,其余随机分为糖尿病组、低剂量治疗组和高剂量治疗组。正常组喂以正常饲料,其余三组均以高脂高糖饲料喂养。药物HMS5552对大鼠进行治疗前,对各组大鼠进行心脏穿刺取血,离心取上清测其胆固醇、甘油三酯、血糖、胰岛素和胰高血糖素指标。HMS5552治疗期间,每天早晨8点,正常组用生理盐水灌胃,糖尿病组用溶解HMS5552的缓冲液灌胃,而低、高剂量治疗组分别以10和30mg/Kg的HMS5552灌胃。期间采用尾部静脉取血法测各组大鼠的空腹血糖、口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT)和口服药物耐量试验(oral drug tolerance test,ODTT)。治疗一个月后处死各组大鼠,取其血液离心取上清测胆固醇、甘油三酯、血糖、胰岛素和胰高血糖素指标。取肝脏、胰腺及小肠新鲜组织做石蜡切片:HE染色观察各组织病理学变化,免疫组织化学染色观察各组织中葡萄糖激酶(glucokinase,GK)、胰岛素(insulin,INS)、胰高血糖素(glucagon,GC)和胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1,GLP-1)的表达。取新鲜肝脏组织,采用6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联比色法测肝脏组织中葡萄糖激酶的Km值;采用Western Blotting和RT-PCR法分别从蛋白水平和核酸水平检测GK的表达变化。结果:(1)2型糖尿病大鼠模型建模成功,空腹血糖值≥8.0mmol/L。(2)空腹血糖结果显示,与正常组比较,糖尿病组空腹血糖持续升高,而治疗组空腹血糖较糖尿病组有不同程度的下降趋势,低剂量治疗组空腹血糖较糖尿病组下降28.57%(P0.05),高剂量治疗组空腹血糖较糖尿病组下降42.45%(P0.05)。(3)OGTT结果显示,正常组血糖峰值出现在15分钟左右,餐后2h血糖值恢复到正常水平;糖尿病组血糖峰值较正常组明显右移,血糖峰值出现在90分钟左右,餐后2h血糖不能恢复到基线水平。治疗一个月后,低剂量治疗组和高剂量治疗组空腹血糖值均有明显改善,血糖峰值与糖尿病组比较,峰值均左移。药时曲线下面积(the area under the concentration time curve,AUC)测量显示,低剂量治疗组和高剂量治疗组ΔAUC0-240与糖尿病组比较,差异有显著统计学意义(P0.01),低剂量治疗组与高剂量治疗组ΔAUC0-240比较,差异无统计学意义(P=0.57)。(4)ODTT结果显示,给予药物HMS5552灌胃后,在30、60、90、120、180、240min,血糖值逐渐下降,240min时与空腹时比较,低剂量治疗组和高剂量治疗组血糖值分别降低了25.73%和26.89%,餐后60min血糖值均较糖尿病组低;经药物治疗一个月后,治疗组空腹血糖值明显降低,给予药物HMS5552灌胃后,240min时与空腹时比较,低剂量治疗组和高剂量治疗组血糖值分别降低了16.67%和21.97%。(5)6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联比色法结果显示,与正常组比较,糖尿病组肝脏组织中葡萄糖激酶Km值明显增加,而治疗组Km值明显下降且高剂量治疗组下降明显(P0.01)。(6)空腹胰岛素结果显示,与正常组比较,糖尿病组空腹胰岛素持续升高,而治疗组空腹胰岛素较糖尿病组有不同程度的下降趋势,低剂量治疗组空腹胰岛素较糖尿病组下降19.71%(P0.05),高剂量治疗组空腹胰岛素较糖尿病组下降47.02%(P0.05)。(7)HE染色结果显示,正常组肝脏形态正常,肝细胞排列致密整齐,呈放射状排列在中央静脉的四周;糖尿病组肝细胞排列疏松,可见严重的脂肪空泡浸润;治疗组肝组织形态较糖尿病组有不同程度的改善。正常组胰腺组织结构形态正常完整;糖尿病组可见部分胰岛细胞有变性萎缩;治疗组胰腺组织形态较糖尿病组有不同程度的改善。(8)免疫组化结果显示,与正常组比较,糖尿病组肝脏GK、胰腺INS和小肠GLP-1表达均明显降低,而治疗组GK、INS和GLP-1较糖尿病组有不同程度的上升。与正常组比较,糖尿病组胰腺GC升高,而治疗组GC较糖尿病组有不同程度的下降。(9)RT-PCR结果显示,与正常组比较,糖尿病组肝脏组织中的GK m RNA表达显著降低,而治疗组肝脏组织中的GK m RNA较糖尿病组表达有不同程度的增加,高剂量治疗组增加明显(P0.01)。(10)Western blotting结果显示,与正常组比较,糖尿病组肝脏组织中的GK蛋白量明显降低,而治疗组肝脏组织中的GK蛋白含量较糖尿病组有不同程度的上升,高剂量治疗组上升明显(P0.01)。结论:(1)采用高脂高糖饲料诱导并结合一次性链脲佐菌素注射的方法成功复制了2型糖尿病大鼠的模型,并且其在生理和病理上的变化与2型糖尿病的临床症状相符合。(2)2型糖尿病大鼠肝脏组织中葡萄糖激酶活性的变化与血糖浓度密切相关。(3)葡萄糖激酶激活剂HMS5552能够使大鼠肝组织GK表达上调。(4)葡萄糖激酶激活剂HMS5552通过对大鼠肝脏GK的浓度和活性的调节来降低血糖的浓度。
【学位授予单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1

文章目录

中文摘要

Abstract

第1章以葡萄糖激酶为靶点治疗2型糖尿病的研究进展

1.1 引言

1.2 葡萄糖激酶（GK）概述

1.3 葡萄糖激酶在2型糖尿病中的活性改变

1.4 葡萄糖激酶激活剂

1.4.1 酰胺类

1.4.2 苯并咪唑类

1.4.3 喹唑啉类

1.4.4 脲类

1.4.5 吡啶类

1.5 调节葡萄糖激酶活性的多种蛋白

1.5.1 葡萄糖激酶调节蛋白（GKRP）

1.5.2 磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2（PFK2/FBPase2）

1.5.3 促凋亡蛋白（BAD）

1.6 葡萄糖激酶基因突变

1.7 存在问题

1.8 展望

第2章前言

2.1 2 型糖尿病的发生发展

2.1.1 病理病因

2.1.2 发病机制

2.1.3 并发症

2.2 2 型糖尿病目前的检查手段和治疗方法

2.2.1 实验室检查诊断方法

2.2.2 治疗方法

2.3 2 型糖尿病动物模型的建立

2.4 2 型糖尿病与葡萄糖激酶

2.5 2 型糖尿病和葡萄糖激酶激活剂

2.6 葡萄糖激酶激活剂治疗2型糖尿病的有效性

2.7 葡萄糖激酶激活剂治疗2型糖尿病的潜在风险和安全性问题

2.8 葡萄糖激酶激活剂治疗2型糖尿病的现状

第3章材料与方法

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

3.1.2 实验仪器

3.1.3 实验试剂

3.1.4 主要试剂配方

3.2 实验方法

3.2.1 2 型糖尿病大鼠模型的建立、分组和HMS5552治疗

3.2.2 OGTT试验

3.2.3 药物耐量试验

3.2.4 各项生化指标的测定

3.2.5 动物取材

3.2.6 肝脏GK的Km值测定

3.2.7 大鼠肝脏及胰腺组织病理切片及染色

3.2.8 免疫组织化学染色

3.2.9 免疫印迹法检测大鼠肝脏组织中GK蛋白的表达

3.2.10 RT-PCR法检测大鼠肝脏组织中GK mRNA的表达

3.2.11统计学处理

第4章结果

4.1 实验动物的一般情况

4.2 2 型糖尿病大鼠模型的成模情况

4.2.1 建模及治疗过程中各组大鼠的体重变化

4.2.2 HMS5552治疗前后各组大鼠的各项生化指标

4.3 HMS5552治疗前后各组大鼠的OGTT结果

4.4 HMS5552治疗前后各组大鼠的药物耐量试验结果

4.5 HMS5552治疗期间各组大鼠的空腹血糖及灌药物后 2h血糖变化

4.6 各组大鼠肝脏组织葡萄糖激酶的Km值结果

4.7 肝脏组织HE染色结果

4.8 胰腺组织HE染色结果

4.9 肝脏组织中GK的免疫组化结果

4.10 胰腺组织中INS的免疫组化结果

4.11 胰腺组织中GC的免疫组化结果

4.12 小肠组织中GLP-1 的免疫组化结果

4.13 RT-PCR法检测大鼠肝脏组织中GK m RNA的表达结果

4.14 Western Blotting法检测大鼠肝脏组织中GK蛋白的表达结果

第5章讨论

5.1 2 型糖尿病大鼠模型的建立

5.2 葡萄糖激酶

5.3 胰岛素

5.4 胰高血糖素

5.5 胰高血糖素样肽-1

5.6 2 型糖尿病中GK的变化

5.7 HMS5552对GK的影响

5.8 问题与展望

第6章结论

参考文献

缩略语词汇表

附录A

致谢

攻读学位期间的研究成果

【参考文献】