高糖环境下miR-29c通过Tristetraprolin影响小鼠足细胞中炎性因子的表达

发布时间：2017-10-13 09:17

  本文关键词：高糖环境下miR-29c通过Tristetraprolin影响小鼠足细胞中炎性因子的表达

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【摘要】：背景糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的严重并发症,在全球范围内广泛流行,是终末期肾脏病(end-stage renal disease,ESRD)最常见的病因。糖尿病肾病的发病机制比较复杂,目前尚不十分明确。越来越多的证据表明炎症激活在糖尿病肾病的发病机制中起促进作用。Tristetraprolin(TTP)是一种RNA结合蛋白,可与多种信使RNA(messager RNA)的3’非编码区(3’untranslated region,3’UTR)含有的AU重复序列(AU-rich element,ARE)结合,促进靶mRNA的降解。已经证实,TTP可与多种炎性因子如白介素家族中的IL-6和TNF-α的mRNA结合并介导其降解,因此TTP又称为“抗炎蛋白”。在糖尿病肾病患者的血清、尿液中,随着尿蛋白的增加,TTP的表达降低,炎性因子IL-6、IL-18的表达升高,且TTP的表达变化发生在炎性因子之前,因此TTP可能参与了糖尿病肾病的炎症反应。微小RNA(MicroRNAs)是一类从转录后水平调控基因表达的内源性非编码的单链小分子RNA,一般由20-22个核苷酸组成。其与靶mRNA的3’UTR区的碱基完全或不完全配对结合,导致mRNA的降解或抑制蛋白翻译过程。我们前期基因芯片的结果显示,miR-29c在糖尿病肾病患者血浆、尿沉渣、肾组织中均有差异表达。有文献报道,miR-29c参与糖尿病肾病的发生发展,抑制miR-29c的表达可以延缓dn的进展。但是mir-29c是否参与糖尿病肾病的炎症反应,目前尚未见相关文献报道。我们应用targetscan软件分析发现ttp可能是mir-29c的靶基因。由此我们提出假设,在高糖环境下的小鼠足细胞中mir-29c通过ttp调控炎性因子的表达,进而参与炎症反应。目的本实验通过观察高糖环境下小鼠足细胞中mir-29c、ttp及炎性因子il-6、tnf-α的表达变化,以及改变mir-29c的表达后ttp及炎性因子il-6、tnf-α的表达变化,探讨mir-29c是否参与高糖环境下的炎症反应,并验证这种作用是否通过ttp介导,为糖尿病肾病发病机制和诊治提供新的理论依据。方法以条件永生化小鼠足细胞为研究对象1.体外培养小鼠足细胞并分为如下三组:正常组(5.6mmol/ld-葡萄糖)、高糖组(25mmol/ld-葡萄糖)、高渗组(5.6mmol/ld-葡萄糖+19.4mmol/ld-甘露醇),分别于不同培养时间下进行检测。qrt-pcr检测mir-29c,ttp及il-6、tnf-αmrna表达水平,westernblot检测ttp的蛋白表达水平,elisa检测il-6、tnf-α蛋白表达水平。观察高糖环境下小鼠足细胞中mir-29c、ttp及炎性因子il-6、tnf-α的表达变化。2.构建野生型和突变型ttp3’utr双荧光素酶质粒,分别与mir-29cmimics共转染小鼠足细胞,并设立转染对照组,转染36h后裂解细胞,应用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性,验证ttp是否是mir-29c的靶基因。3.将mir-29cmimics和inhibitor分别转染入正常糖浓度下培养的小鼠足细胞,并设立正常对照组和转染对照组,分别于不同培养时间下进行检测。qrt-pcr检测mir-29c,ttp及il-6、tnf-αmrna表达水平,westernblot检测ttp的蛋白表达水平,elisa检测il-6、tnf-α蛋白表达水平。观察改变mir-29c的表达后,ttp及炎性因子il-6、tnf-α的表达变化。4.体外培养小鼠足细胞并分为如下四组:正常组(5.6mmol/ld-葡萄糖)、高糖组(25mmol/ld-葡萄糖)、高糖转染inhibitor组(25mmol/ld-葡萄糖+mir-29cinhibitor)、高糖转染对照组(25mmol/ld-葡萄糖+mir-control),分别于不同培养时间下进行检测。qrt-pcr检测mir-29c,ttp及il-6、tnf-αmrna表达水平,westernblot检测ttp的蛋白表达水平,elisa检测il-6、tnf-α蛋白表达水平。观察高糖环境下,改变mir-29c的表达后,ttp及炎性因子il-6、tnf-α的表达变化。结果1.高糖环境下,mir-29c、ttp及炎性因子il-6、tnf-α的表达变化与正常对照组相比,高糖组mir-29c的表达明显升高,ttp蛋白及mrna的表达降低,il-6、tnf-α蛋白及mrna的表达升高,差异具有统计学意义(p0.05)。2.ttp是mir-29c的靶基因成功构建野生型和突变型ttp3’utr-pmirglo质粒,分别与mir-29cmimics共转染小鼠足细胞。双荧光素酶报告基因检测结果显示,与突变型ttp3’utr和mir-29cmimics共转染组相比,野生型ttp3’utr和mir-29cmimics共转染组检测到的荧光降低,差异具有统计学意义(p0.05)。与正常对照组相比,mir-29cinhibitor转染组ttp蛋白及mrna的表达升高,mir-29cmimics转染组ttp蛋白及mrna的表达降低,差异具有统计学意义(p0.05)。3.改变mir-29c的表达后炎性因子il-6、tnf-α的表达变化与正常对照组相比,mir-29cinhibitor转染组il-6、tnf-α蛋白及mrna的表达降低,mir-29cmimics转染组il-6、tnf-α蛋白及mrna的表达升高,差异具有统计学意义(p0.05)。4.高糖环境下,改变mir-29c的表达后ttp及炎性因子il-6、tnf-α的表达变化与正常对照组相比,高糖组ttp蛋白及mrna的表达降低,il-6、tnf-α蛋白及mrna的表达升高,差异具有统计学意义(p0.05)。与高糖组相比,高糖转染mir-29cinhibitor组ttp蛋白及mrna的表达增加,il-6、tnf-α蛋白及mrna的表达降低,差异具有统计学意义(p0.05)。结论1.高糖影响小鼠足细胞中miR-29c及炎性因子IL-6、TNF-α的表达。2.TTP是miR-29c的靶基因。3.高糖环境下,miR-29c通过TTP调控小鼠足细胞中炎性因子的表达,进而参与炎症反应。
【关键词】：糖尿病肾病 小鼠足细胞 miR-29c TTP 炎性因子 双荧光素酶报告基因检测
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R692.9
【目录】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-14
• 中英文对照缩略词14-15
• 前言15-17
• 材料和方法17-41
• 结果41-51
• 讨论51-54
• 结论54-55
• 参考文献55-59
• 综述 MIRNAS在糖尿病肾病中的作用59-72
• 参考文献67-72
• 个人简历及在校期间发表的学术论文72-73
• 致谢73

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本文编号：1024038