雌二醇通过Wnt信号通路调节大鼠BMSCs成骨分化机制研究

发布时间：2017-10-14 22:31

  本文关键词：雌二醇通过Wnt信号通路调节大鼠BMSCs成骨分化机制研究

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【摘要】：目的:观察不同浓度17β-雌二醇对大鼠BMSCs成骨分化的影响,并分析成骨分化过程中经典Wnt信号通路相关信号转导分子的表达差异,探索17β-雌二醇通过Wnt/β-catenin信号通路调节大鼠BMSCs成骨分化的作用机制,为临床应用雌激素或SERMs治疗PMOP提供理论依据。方法:应用全骨髓培养法分离4周龄雄性SD大鼠双下肢的骨髓单个核细胞,通过多次换液及传代时控制胰酶消化时间纯化BMSCs;利用BMSCs的三个特性对其进行鉴定,(1)贴壁特性;(2)多向分化潜能:对P2代细胞分别进行成骨、成脂诱导并设空白对照,每3天全量换液,于成骨诱导第7天进行ALP染色,成骨诱导第21天进行Alizarin Red S染色,成脂诱导14天进行Oil Red O染色,观察其分化能力;(3)利用流式细胞仪对细胞表面标志物进行检测:CD34、CD44、CD45、CD105。将鉴定成功的大鼠BMSCs接种于多个6孔板中,进行分组培养,分别为0、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L组,待每孔细胞达到约80%融合,以相应梯度浓度17β-雌二醇处理各组细胞,DMSO处理作为对照组,同时对各组进行成骨诱导,每3天全量换液,于成骨诱导第7天进行ALP染色并进行ALP定量分析,成骨诱导第7天分别提取各组细胞总蛋白,利用Western blot检测各组细胞Wnt10b、β-catenin、LRP5表达量,成骨诱导第21天进行Alizarin Red S染色。结果:利用全骨髓培养法分离出的大鼠骨髓中的单个核细胞形态良好,增殖能力强;通过多次换液及传代时控制胰酶消化时间可纯化BMSCs,P2代细胞纯度可达95%;对P2代细胞分别进行成骨诱导和成脂诱导,经鉴定BMSCs可向成骨细胞及脂肪细胞分化;利用流式细胞术鉴定P2代细胞,证实所得细胞为间充质来源且均一性较高;对P2代细胞进行成骨诱导的同时用梯度浓度(0、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L)的17β-雌二醇进行处理,成骨诱导7天后ALP染色及定量分析显示,随着17β-雌二醇浓度的增加,ALP表达量逐渐增加,且活性增强,其中10-5 mol/L组活性最强,各处理组与空白对照组比较差异均具有统计学意义;成骨诱导第7天,对各组目标蛋白表达量进行Western blot检测显示:Wnt10b、β-catenin表达量随着17β-雌二醇浓度的增加而逐渐增加,10-5mol/L组最高,LRP5各组表达量无明显差异;成骨诱导第21天Alizarin Red S染色结果显示:各组红褐色矿化结节的数量亦随着17β-雌二醇浓度的增高而逐渐增加。结论:通过全骨髓培养法可分离筛选出纯度高、均一性好、增殖能力强的BMSCs;BMSCs在特定的诱导条件下可向成骨细胞及脂肪细胞分化,具有多向分化潜能;体外成骨诱导培养条件下,雌激素可浓度依赖性的促进大鼠BMSCs成骨分化,参与成骨细胞的分化成熟,并且此效应可能是通过上调经典Wnt信号通路中Wnt10b及β-catenin的表达实现的,而雌激素对经典Wnt信号通路中膜受体LRP5的表达无明显影响。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 雌激素 经典Wnt信号通路 成骨分化 骨质疏松
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R580
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-14
• 研究现状、成果11-12
• 研究目的、方法12-14
• 一、大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定14-21
• 1.1 对象和方法14-18
• 1.1.1 实验动物14
• 1.1.2 仪器与试剂14-15
• 1.1.3 试剂配制15
• 1.1.4 实验方法15-18
• 1.2 结果18-19
• 1.2.1 原代培养18
• 1.2.2 传代培养18
• 1.2.3 碱性磷酸酶染色18-19
• 1.2.4 茜素红S染色19
• 1.2.5 油红O染色19
• 1.2.6 细胞表面标记物鉴定19
• 1.3 讨论19-20
• 1.3.1 间充质干细胞19
• 1.3.2 分离方法19-20
• 1.3.3 BMSCs鉴定方法20
• 1.4 小结20-21
• 二、雌二醇通过Wnt信号通路调节大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化机制研究21-32
• 2.1 对象和方法21-27
• 2.1.1 骨髓间充质干细胞21
• 2.1.2 仪器与试剂21-22
• 2.1.3 试剂配制22-23
• 2.1.4 实验方法23-27
• 2.2 结果27-28
• 2.2.1 碱性磷酸酶染色及定量分析27-28
• 2.2.2 茜素红染色28
• 2.2.3 Western blot28
• 2.3 讨论28-31
• 2.3.1 雌二醇对BMSCs成骨分化的影响28-29
• 2.3.2 雌二醇对经典Wnt信号通路的影响29-31
• 2.4 小结31-32
• 结论32-33
• 参考文献33-36
• 发表论文和参加科研情况说明36-37
• 附录37-44
• 综述 绝经后骨质疏松症的临床研究进展44-64
• 综述参考文献56-64
• 致谢64-65
• 个人简历65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 杜晓丽;郑德三;吕红玲;;绝经后女性骨质疏松症的影响因素及中医证型分布规律初探[J];世界中医药;2014年06期

2 吴军;张燕燕;;骨髓间充质干细胞生物学特性及临床应用进展[J];中国组织工程研究与临床康复;2007年50期

3 张本斯,王凡,邓力,顿爱社,董立华,李健,羊惠君;大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及表型和功能特点[J];四川大学学报(医学版);2003年04期

4 曾晓峰,赵建宁;肿瘤坏死因子受体和配体超家族的新成员[J];生命的化学;2003年04期

5 李宁华,区品中,朱汉民,杨定焯,郑，

本文编号：1033546