下丘脑CB1R及内源性大麻素水解酶参与T2DM雄性猕猴HPA轴功能调节

发布时间：2017-10-15 09:42

  本文关键词：下丘脑CB1R及内源性大麻素水解酶参与T2DM雄性猕猴HPA轴功能调节

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【摘要】：[目的]下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamo-pituitary-adrenal,HPA)轴作为机体能量代谢的调节中枢,在2型糖尿病发生过程中起重要作用。下丘脑内分布有大量大麻素受体,大麻素系统可广泛调节中枢神经系统神经元的功能。目前关于大麻素系统对HPA轴的作用研究较少,因此大麻素系统对HPA轴的作用在2型糖尿病发病机制中的研究具有重要价值。本文选择经高脂饮食诱导24月,成功建立的2型糖尿病及糖尿病前期川西亚种雄性猕猴,研究其下丘脑、垂体及肾上腺脂肪酸酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase, FAAH)、单酰甘油酯酶(monoglycerol lipase, MAGL)、大麻素1型受体(cannabinoid 1 receptor, CB1R)、促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)、促肾上腺皮质激素释放激素受体(corticotropin releasing hormone receptor 1, CRHR1)、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone, ACTH)、促肾上腺皮质激素受体(adrenocorticotropic hormone receptor, ACTHR)、糖皮质激素受体(glucocorticoids receptor, GR)及糖皮质激素的表达变化,据此探讨2型糖尿病进程中,(1)HPA轴功能变化；(2)内源性大麻素受体及水解酶在HPA轴中的作用。[方法]将15只川西亚种雄性猕猴,根据空腹血糖水平及2小时餐后血糖分为健康组(5只),糖尿病前期组(5只)及显性糖尿病组(5只)。经麻醉处死后,取下丘脑、垂体及肾上腺固定或低温冻存。HE染色检测组织病理变化,免疫组织化学SABC蓝色显色法检测蛋白质表达分布及水平,蛋白质印迹法检测蛋白质表达量,实时荧光定量PCR检测基因相对表达量,免疫酶联吸附实验检测肾上腺皮质醇水平。[结果]组织形态学观察显示,从健康到糖尿病前期再到显性糖尿病的猕猴出现下丘脑室旁核神经元萎缩,显性糖尿病猕猴神经垂体形成较多少量均质红染团块,腺垂体嗜酸性细胞增多,肾上腺束状带细胞呈渐进性肿胀的病变特征。免疫组化染色结果显示：各组猕猴下丘脑室旁核均分布有CRH、CB、FAAH及MAGL,CRHR1分布于各组猕猴神经垂体,ACTH分布于各组猕猴腺垂体,各组猕猴肾上腺束状带分布有ACTHR,GR分布于糖尿病前期及显性期猕猴下丘脑室旁核及腺垂体：从健康、前期到显性,下丘脑室旁核CRH积分光密度值逐渐减少(P0.05),神经垂体CRHR1积分光密度值先降低后升高(P0.01),腺垂体ACTH积分光密度值先下降后恢复至健康水平(P0.01),肾上腺束状带ACTHR积分光密度值呈逐渐升高的趋势(P0.05),下丘脑室旁核及腺垂体GR积分光密度值逐渐降低(P0.05),下丘脑室旁核CB1R积分光密度值逐渐降低(P0.01), FAAH表达逐渐增多(P0.05), MAGL表达逐渐增多(P0.05)。蛋白质印迹统计结果显示：从健康、前期到显性,下丘脑CRH及GR蛋白质相对表达量逐渐减少(P0.05),而垂体ACTH、肾上腺ACTHR逐渐增多(P0.05),垂体CRHR1呈先减少后增多的趋势(P0.01),下丘脑CB1R蛋白质相对表达量逐渐减少(P0.01),下丘脑FAAH及MAGL逐渐增多(P0.01)。实时荧光定量PCR结果显示：从健康、前期到显性,下丘脑CRH基因相对表达量逐渐减少(P0.01),垂体CRHR1基因相对表达量先降低后升高(P0.01),垂体ACTH基因(POMC)相对表达量呈显著升高趋势(P0.05),肾上腺ACTHR基因(MC2R)相对表达量呈逐渐降低趋势(P0.01),皮质醇合成限速酶11β-羟基类固醇脱氢酶基因(CYP11B1)相对表达量逐渐升高P0.05),下丘脑及垂体GR基因(NR3CD相对表达量呈逐渐下降趋势(P0.05)；CB1R基因(CNR1)相对表达量在糖尿病前期显著下调,显性期则进一步下调(P0.05); FAAH (FAAH)先减少后增多(P0.05), MAGL (MGLL)相对表达量逐渐增多(P0.01)。免疫酶联吸附试验结果显示,肾上腺皮质醇含量从健康到前期及显性期逐渐升高(P0.01)。[结论]从健康、前期到显性,HPA轴分泌功能逐渐增强,糖皮质激素负反馈对HPA轴的抑制作用减弱。同时,CB1R表达逐渐减少,大麻素水解酶表达逐渐增多,表示在2型糖尿病发生过程中,减弱了CB1R及大麻素水解酶对HPA轴分泌功能的抑制作用。
【关键词】：2型糖尿病 下丘脑-垂体-肾上腺轴 大麻素1型受体 内源性大麻素水解酶 猕猴
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 缩略词表9-14
• 1 文献综述14-27
• 1.1 糖尿病概况及发病机理14-15
• 1.2 糖尿病诊断标准及治疗方法15-16
• 1.2.1 糖尿病诊断标准15
• 1.2.2 糖尿病治疗药物及措施15-16
• 1.3 2型糖尿病动物模型16-17
• 1.4 下丘脑-垂体-肾上腺轴17-21
• 1.4.1 下丘脑-垂体-肾上腺轴分泌特点17-19
• 1.4.2 下丘脑-垂体-肾上腺轴功能紊乱与2型糖尿病19-21
• 1.5 内源性大麻素系统21-25
• 1.5.1 大麻素与内源性大麻素系统21-23
• 1.5.2 内源性大麻素系统在2型糖尿病发病过程中的变化23-25
• 1.6 内源性大麻素系统参与HPA轴调控与糖尿病的发生25-27
• 2 选题意义27
• 实验部分27-59
• 1 实验材料27-31
• 1.1 实验动物27-28
• 1.2 实验仪器28-29
• 1.3 耗材与试剂29-30
• 1.4 部分溶液配制30-31
• 2 实验方法31-39
• 2.1 样品采集31-32
• 2.2 免疫组织化学检测CRH、CRHR1、ACTH、ACTHR、GR、CB1R、FAAH及MAGL组织分布32-33
• 2.2.1 下丘脑、垂体及肾上腺石蜡切片制作32
• 2.2.2 免疫组织化学SABC法32
• 2.2.3 显微摄影、图像分析及数据处理32-33
• 2.3 蛋白质印迹法检测CRH、CRHR1、ACTH、ACTHR、GR、CB1R、FAAH及MAGL蛋白表达量33-35
• 2.3.1 组织蛋白提取33
• 2.3.2 BCA蛋白质浓度测定33
• 2.3.3 蛋白质电泳33-34
• 2.3.4 免疫印迹34
• 2.3.5 数据分析34-35
• 2.4 实时荧光定量PCR检测CRH、POMC、CYP11B1、CRHR1、MC2R、NR3C1、CNR1、FAAH及MGLL的基因表达量35-37
• 2.4.1 引物设计及用品处理35
• 2.4.2 总RNA提取35-36
• 2.4.3 总RNA纯度和完整性检测36
• 2.4.4 去除基因组DNA及反转录36-37
• 2.4.5 Real-Time PCR37
• 2.5 免疫酶联吸附实验检测肾上腺皮质醇含量37-38
• 2.5.1 样品处理37-38
• 2.5.2 肾上腺皮质醇含量检测38
• 2.6 数据统计分析38-39
• 3 实验结果39-54
• 3.1 下丘脑-垂体-肾上腺病理变化39-42
• 3.2 下丘脑-垂体-肾上腺轴分泌功能变化42-50
• 3.2.1 CRH、CRHR1、ACTH、ACTHR及GR免疫组织化学染色结果42-46
• 3.2.2 CRH、CRHR1、ACTH、ACTHR及GR蛋白质印迹检测结果46
• 3.2.3 CRH、POMC、CYP11B1、CRHR1、MC2R及NR3C1荧光定量PCR检测结果46-49
• 3.2.4 肾上腺皮质醇浓度变化ELISA检测结果49-50
• 3.3 下丘脑内源性大麻素受体及大麻素水解酶表达变化50-54
• 3.3.1 CB1R、FAAH及MAGL免疫组织化学染色50-51
• 3.3.2 CB1R、FAAH及MAGL蛋白质印迹检测结果51-52
• 3.3.3 CNR1、FAAH及MGLL荧光定量PCR检测结果52-54
• 4 讨论54-57
• 4.1 糖尿病猕猴下丘脑-垂体-肾上腺轴激素及受体变化54-55
• 4.2 糖尿病猕猴下丘脑大麻素受体及内源性大麻素水解酶变化55-56
• 4.3 糖尿病发病过程中内源性大麻素系统与HPA轴紊乱的关系56-57
• 5 结论与创新点57-59
• 5.1 结论57-58
• 5.2 创新点58-59
• 参考文献59-70
• 致谢70-71
• 攻读学位期间第一作者身份发表的学术论文71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：1036438