IL-6调控类风湿关节炎患者外周血淋巴细胞P-糖蛋白信号转导通路的研究

发布时间：2017-10-15 12:08

  本文关键词：IL-6调控类风湿关节炎患者外周血淋巴细胞P-糖蛋白信号转导通路的研究

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【摘要】：背景:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是高度致残性自身免疫性疾病,目前RA治疗领域中的最大挑战是改善病情抗风湿药(Disease-modifying antirheumatic drugs,DMARDs)多药耐药性(multidrug resistance,MDR)的产生。ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)跨膜转运蛋白所介导的药物排出增加可能是多药耐药性产生的关键机制,其中最典型的药物排出机制即多药耐药基因1(MDR1)及其编码的细胞膜表面P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达增加。本课题为类风湿关节逆转耐药研究的系列研究之一,我们的前期研究证实:1.RA患者外周血淋巴细胞P-gp的表达水平明显增加,且与炎性指标(血沉、C-反应蛋白)及疾病活动度(DAS28)相关,说明其参与了多药耐药的形成。2.不同治疗组P-gp表达水平的比较中,联合用药较单用药P-gp表达水平减少,表明MTX/LFE周期联合CTX一定程度逆转P-gp表达。3.IL-6刺激后,RA外周血淋巴细胞中P-gp的表达和功能均增强,且具有一定的时间依赖性及浓度依赖性。P-gp的调控机制非常复杂,其中,细胞因子的角色愈发受到重视。白介素-6(Interleukin-6,IL-6)作为一种多效应细胞因子,参与RA的全部致病过程。本课题前期研究已证明:1.RA患者外周血淋巴细胞上P-gp的表达水平明显增加,且与炎性指标(血沉、C-反应蛋白)及疾病的活动度(DAS28)相关。2.IL-6刺激后,RA患者外周血淋巴细胞上P-gp的表达和功能均增强,且具有一定的时间及浓度依赖性。那么,IL-6具体如何调控P-gp的表达,其具体信号通路是什么?是本课题的科学问题。细胞因子对细胞的调控作用主要通过胞内信号转导途径来介导。众多研究表明,细胞信号转导通路在自身免疫性疾病的发病机制中的角色愈发重要,其关键酶的特异性抑制剂也成为最有前途的靶向治疗药物之一。本课题即从研究较多的mapk途径和jak-stat途径入手,探究il-6调控ra患者外周血淋巴细胞p-gp的具体信号转导通路,以明确il-6对ra患者外周血淋巴细胞p-gp的具体调控机制。目的:通过不同细胞通路抑制剂预处理后,加入il-6共培养72h,观察各组外周血淋巴细胞的mrna合成水平、膜表面蛋白水平及其功能,明确炎症细胞因子il-6调控ra患者外周血淋巴细胞p-gp的信号转导通路。方法:选取初治ra患者20例,用肝素抗凝管采集外周血标本20ml,提取外周血淋巴细胞,建立外周血淋巴细胞培养体系,a组为空白对照组,在c、d组分别加入jak2-stat3通路抑制剂ag490(50um)、erk1/2通路抑制剂pd98059(20um)进行预处理。处理30min后,b、c、d组均加入il-6,浓度2ng/ml,置于37℃c02培养箱中,饱和湿度下培养,在72h收集细胞,rt-pcr的方法测外周血淋巴细胞p-gpmrna的合成,westernblot测定外周血淋巴细胞细胞膜上p-gp蛋白水平,罗丹明123蓄积实验检测外周血淋巴细胞p-gp的功能。分析不同通路抑制剂对il-6调控ra外周血淋巴细胞p-gp的影响。结果:1、rt-pcr检测各组外周血淋巴细胞p-gpmrna水平:与空白对照组相比,il-6组p-gpmrna表达水平明显升高(p0.05);与il-6组相比,ag490预处理+il-6组与pd98059预处理+il-6组的p-gpmrna表达水平均降低,差异均有统计学意义(p0.05);空白对照组、ag490+il-6组、pd98059+il-6组两两比较组间无差异(p0.05)。2、Western Blot检测各组外周血淋巴细胞p-gp蛋白水平:与空白对照组相比,IL-6组外周血淋巴细胞膜表面P-gp蛋白水平明显升高(P0.05);与IL-6组相比,AG490预处理+IL-6组与PD98059预处理+IL-6组的外周血淋巴细胞膜表面P-gp蛋白水平均降低,差异均有统计学意义(P0.05);空白对照组、AG490+IL-6组、PD98059+IL-6组两两比较组间无差异(P0.05)。3、Rh123蓄积实验检测各组外周血淋巴细胞P-gp的功能:与空白对照组相比,IL-6组Rh123蓄积量明显减少,说明P-gp功能增强(P0.05);与IL-6组相比,AG490预处理+IL-6组与PD98059预处理+IL-6组的Rh123蓄积量均增加,说明P-gp功能减弱,差异均有统计学意义(P0.05);空白对照组、AG490+IL-6组、PD98059+IL-6组两两比较组间无差异(P0.05)。结论:1、炎性细胞因子IL-6刺激后,RA外周血淋巴细胞耐药膜转运蛋白P-gp mRNA合成水平、蛋白表达水平及功能均明显增强。2、ERKl/2信号转导通路抑制剂PD98059及JAK2-STAT3信号转导通路抑制剂AG490二者均可抑制IL-6诱导的RA外周血淋巴细胞P-gp mRNA合成水平、蛋白水平及功能的增强。3、ERKl/2、JAK2-STAT3信号转导通路参与IL-6对RA外周血淋巴细胞P-gp的调控。
【关键词】：类风湿关节炎 外周血淋巴细胞 P-糖蛋白 多药耐药性 白介素-6 信号转导通路
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R593.22
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-15
• 技术路线图15-16
• 1 材料与方法16-26
• 1.1 实验材料16-18
• 1.2 研究方法18-25
• 1.3 统计学分析25-26
• 2 实验结果26-31
• 2.1 RT-PCR检测各组外周血淋巴细胞P-gp mRNA水平26-27
• 2.2 Western Blot检测各组外周血淋巴细胞P-gp蛋白水平27-28
• 2.3 Rh123蓄积实验检测各组外周血淋巴细胞P-gp的功能28-31
• 3 讨论31-35
• 3.1 P-gp与RA多药耐药的相关性研究31-32
• 3.2 RA中P-gp与IL-6 的相关性研究32
• 3.3 IL-6 对RA外周血淋巴细胞P-gp调控机制的研究32-34
• 3.4 展望34-35
• 4 结论35-36
• 本研究创新点36-37
• 参考文献37-40
• 综述40-49
• 参考文献46-49
• 在校期间参与研究课题及成果49-50
• 致谢50-52
• 个人简历52

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本文编号：1037023