mTOR信号通路在糖尿病肾病大鼠足细胞损伤中的研究

发布时间：2017-10-23 04:13

  本文关键词：mTOR信号通路在糖尿病肾病大鼠足细胞损伤中的研究

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【摘要】：目的:通过阻断哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin mTOR)信号通路对糖尿病肾病(diabetic nephropathy DN)大鼠足细胞Ezrin、α-SMA蛋白及外周血Th17/Treg细胞的研究,探讨mTOR通路对DN足细胞骨架蛋白和肌动蛋白合成的影响及Th17/Treg是否通过mTOR信号通路调控足细胞相关蛋白,为DN的治疗提供新的靶点。方法:(1)模型的建立、分组:40只SD雄性大鼠,适应性喂养1周,随机分为2组:正常组(A组)10只,模型组30只;模型组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin STZ),剂量为55mg/Kg,3天后用血糖仪测血糖,以随机血糖值≥16.7mmol/L且稳定5天为DN造模成功;若未达标,另追加50mg/kg STZ,并在追加后3天后复测血糖。成功模型组随机分为DN组(B组)、DN+他克莫司(tacrolimus FK506)干预组(C组)、DN+ku0063794干预组(D组)各10只;C、D组每天分别予FK506 1mg/kg/d、ku0063794 1mg/kg/d灌胃,A组、B组分别予以等量生理盐水灌胃。实验0周、4周、8周分别检测A、B、C、D四组大鼠体重、血糖、血肌酐、尿肌酐、24小时尿蛋白定量,ELISA检测各组大鼠外周血IL-17、TGF-β1因子,流式细胞学检测CD4+CD25high Treg细胞占CD4+T百分比率;4、8周时处死各组一半大鼠取肾组织利用RT-PCR检测Ezrin-mRNA、α-SMA-mRNA及Western blotting检测mTOR、Raptor、Rictor、Ezrin、α-SMA蛋白。结果:(1)生化指标(1)24h尿蛋白定量,组间比较:0周时,B组、C组、D组较A组明显升高(P0.01),B组、C组、D组间无统计学差异;4周时,B组、C组、D组较A组明显升高(P0.01),C组、D组低于B组(P0.05),D组与C组无统计学差异;8周时,B组明显高于A组(P0.001),C组、D组明显低于B组(P0.001),A组、C组、D组无统计学差异。组内比较:B组8周明显高于0周(P0.05);C组、D组8周明显低于0周(P0.05)。(2)Ccr,组间比较:4周时,B组较A组下降(P0.05),D组高于B组(P0.05),c组与b组、d组无统计学差异;8周时,b组较a组明显下降(p0.05),c组、d组明显高于b组(p0.05),d组与c组无统计学差异。组内比较无统计学差异。(2)westernblotting指标:(1)mtor蛋白,组间比较:4周时,b组、c组、d组较a组升高(p0.05),c组低于b组(p0.05),d组与b组、c组无统计学差异;8周时,b组较a组明显升高(p0.05),c组、d组明显低于b组(p0.001),a组、c组、d组无统计学差异。组内比较无统计学差异。(2)raptor蛋白,组间比较:4周、8周时,b组、c组、d组较a组升高(p0.05),c组、d组明显低于b组(p0.05),d组与c组无统计学差异。组内比较:c组8周低于4周(p0.05)。(3)rictor蛋白,组间比较:4周时,b组、c组、d组较a组升高(p0.05),c组、d组较b组明显降低(p0.05),d组与c组无统计学差异差异;8周时,b组较a组明显升高(p0.001),c组、d组明显低于b组(p0.001),a组、c组、d组间无统计学差异。组内比较无统计学差异。(4)ezrin蛋白,组间比较:4周时,b组、c组、d组较a组降低(p0.05),c组、d组高于b组(p0.05),d组与c组无统计学差异;8周时,b组较a组明显降低(p0.05),c组、d组明显高于b组(p0.05),a组、c组、d组间无统计学差异。组间比较:b组8周低于4周(p0.05)。(5)α-sma蛋白,组间比较:4周时,b组、c组、d组较a组升高(p0.05),c组、d组低于b组(p0.05),d组与c组无统计差异;8周时,b组、c组、d组较a组升高(p0.05),c组、d组明显低于b组(p0.05),d组低于c组(p0.05)。组内比较:b组8周高于4周(p0.05);c组、d组8周均低于4周(p0.05)。(3)rt-pcr指标:(1)ezrin-mrna,组间比较:4、8周时,b组、c组、d组较a组降低(p0.05),c组、d组高于b组p0.05),c组与d组无统计学差异(p0.05)。组内比较无统计学差异。(2)α-sma-mrna,组间比较:4周时,b组、c组、d组较a组升高(p0.05),c组、d组明显低于b组(p0.001),d组与c组无统计学差异;8周时,b组、c组较a组升高(p0.05),c组、d组明显低于b组(p0.001),d组与a组、c组无统计学差异。组内比较无统计学差异。(4)流式细胞学指标:cd4+cd25hightreg百分比,组间比较:4周、8周时,b组较a组明显降低(p0.05),c、d高于b组(p0.05),a组、c组、d组间无统计学差异。组内比较:b组8周、4周较0周明显降低(p0.001);D组4周高于8周(P0.05)。(5)ELISA指标:(1)TGF-β1,组间比较:4周时,B组、D组较A组升高(P0.05),D组低于B组(P0.05),C组与A组、B组、D组无统计学差异;8周时,B组较A组明显升高(P0.05),C组、D组均与A组、B组无统计学差异,D组高于C组(P0.001)。组内比较:B组、C组、D组4周、8周均高于0周(P0.05),D组8周高于4周(P0.05)。(2)IL-17,组间比较:4周时,B组、C组较A组升高(P0.05),C组、D组低于B组(P0.05),D组与A组、C组无统计学差异;8周时,B组、C组较A组升高(P0.05),C组与B组无统计学差异,D组与A组、B组、C组无统计学差异。组内比较:A组8周高于0周(P0.05);B组、C组、D组4周、8周明显高于0周(P0.05)。(6)相关性分析:(1)B组大鼠4周时,Rictor与与α-SMA-mRNA呈正相关,与Ezrin、Ezrin-mRNA呈负相关;8周时,Rictor与α-SMA、TGF-β1、IL-17呈正相关,与Ezrin、CD4+CD25high Treg呈负相关;Raptor与Ezrin、Ezrin-mRNA、α-SMA、α-SMA-mRNA、CD4+CD25high Treg、TGF-β1、IL-17无相关。(2)B组大鼠4周、8周时,CD4+CD25high Treg与TGF-β1蛋白呈均负相关。(3)B组大鼠4周、8周Ezrin-mRNA与CD4+CD25high Treg均呈正相关;8周时,Ezrin、Ezrin-mRNA与TGF-β1、IL-17负相关;(4)B组大鼠4周时,α-SMA-mRNA与IL-17呈正相关,与CD4+CD25high Treg负相关。结论:1、阻断mTOR通路DN大鼠肾脏能升高肾小球滤过率、降低尿蛋白、改善大鼠精神状态。2、mTORC2信号通路参与了DN的足细胞的Ezrin、α-SMA蛋白的表达。3、Treg可能通过mTORC2信号通路调控Ezrin、α-SMA蛋白的合成。4、FK506也可同时阻断mTORC1、mTORC2信号通路。
【关键词】：糖尿病肾病 mTOR信号通路 足细胞蛋白 Th17/Treg
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R692.9
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-13
• 中英文缩略词表13-14
• 第1章 引言14-17
• 第2章 材料和方法17-28
• 2.1 试验材料17-19
• 2.1.1 动物实验17
• 2.1.2 材料17-19
• 2.2 试验方法19-27
• 2.2.1 DN动物模型的建立19
• 2.2.2 DN动物模型的分组19
• 2.2.3 标本的收集19-20
• 2.2.4 各项指标检测20-27
• 2.3 统计学处理27-28
• 第3章 实验结果28-52
• 3.1 各组大鼠的一般情况比较28
• 3.2 大鼠的体重及生化参数28-33
• 3.2.1 大鼠体重28-29
• 3.2.2 大鼠血糖29-30
• 3.2.3 大鼠 24h 尿蛋白30-31
• 3.2.4 大鼠内生肌酐清除率31-33
• 3.3 大鼠肾组织mTOR、raptor、rictor、Ezrin、α-SMA蛋白表达33-38
• 3.3.1 肾脏组织mTOR蛋白33-34
• 3.3.2 肾脏组织Raptor蛋白34-35
• 3.3.3 肾脏组织Rictor蛋白35-36
• 3.3.4 肾脏组织Ezrin蛋白36-37
• 3.3.5 肾脏组织α-SMA蛋白37-38
• 3.4 大鼠肾组织Ezrin-mRNA、α-SMA-mRNA的表达38-41
• 3.4.1 大鼠肾脏组织Ezrin-mRNA38-39
• 3.4.2 大鼠肾脏组织α-SMA-mRNA39-41
• 3.5 大鼠外周血CD~(4+)CD25~(high) Treg细胞百分比41-43
• 3.6 大鼠外周血TGF-β1、IL-17的表达43-45
• 3.6.1 大鼠外周血TGF-β143-44
• 3.6.2 大鼠外周血IL-1744-45
• 3.7 B组大鼠Raptor、Rictor、Ezrin、Ezrin-mRNA、α-SMA、α-SMA-mRNA、CD~(4+)CD25~(high) Treg、TGF-b1、IL-17的相关分析。45-52
• 3.7.1 B组大鼠Ezrin与Raptor、Rictor的相关分析45-46
• 3.7.2 B组大鼠Ezrin-mRNA与Raptor、Rictor的相关分析46
• 3.7.3 B组大鼠α-SMA与Raptor、Rictor的相关分析46-47
• 3.7.4 B组大鼠α-SMA-mRNA与Raptor、Rictor的相关分析47
• 3.7.5 B组大鼠CD~(4+)CD25~(high) Treg与Raptor、Rictor的相关分析47
• 3.7.6 B组大鼠TGF-β1 与Raptor、Rictor的相关分析47-48
• 3.7.7 B组大鼠IL-17与Raptor、Rictor的相关分析48
• 3.7.8 B组大鼠CD~(4+)CD25~(high) Treg与TGF-β1 相关分析48-49
• 3.7.9 B组大鼠CD~(4+)CD25~(high) Treg与Ezrin、Ezrin-mRNA相关分析· 3649
• 3.7.10 B组大鼠CD~(4+)CD25~(high) Treg与α-SMA、α-SMA-mRNA相关分析49
• 3.7.11 B组大鼠TGF-β1 与Ezrin、Ezrin-mRNA相关分析49-50
• 3.7.12 B组大鼠TGF-β1 与α-SMA、α-SMA-mRNA相关分析50
• 3.7.13 B组大鼠IL-17与Ezrin、Ezrin-mRNA相关分析50-51
• 3.7.14 B组大鼠IL-17与α-SMA、α-SMA-mRNA相关分析51-52
• 第4章 讨论52-58
• 4.1 mTOR、Raptor、Raptor蛋白在DN中的表达及其临床意义52-54
• 4.2 Ezrin、α-SMA蛋白在DN中的表达及其临床意义54-55
• 4.3 Th17/Treg细胞在DN中的表达及其临床意义55-58
• 第5章 结论与展望58-59
• 5.1 结论58
• 5.2 展望58-59
• 致谢59-60
• 参考文献60-64
• 攻读学位期间的研究成果64-65
• 综述65-70
• 参考文献69-70

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