高糖诱导miR-9抑制IL-33表达的功能机制

发布时间：2017-10-30 07:25

  本文关键词：高糖诱导miR-9抑制IL-33表达的功能机制

  更多相关文章： 白介素33 miR-9 SHP-1 糖尿病 炎症

【摘要】：炎症反应对于皮肤伤口愈合过程至关重要。适度的炎症反应有利于促进正常伤口愈合,抵抗微生物感染,维持机体平衡,然而炎症反应过度就会适得其反,造成伤口愈合困难。过度炎症反应是导致一些慢性皮肤伤口如糖尿病皮肤伤口难愈合的主要原因之一。然而糖尿病高糖环境是如何导致炎症应答失调,目前尚无报道。我们及其他课题组的研究结果都表明：在糖尿病伤口中IL-33低表达并且伴随着TLR3依赖的前炎症因子TNF-a和IL-6的高表达。然而对于IL-33在糖尿病中低表达的机制目前却无报道,糖尿病中IL-33的低表达是否与糖尿病伤口过度炎症有关也不清楚。本研究首先用高糖和IL-17或TLR3配体poly(I:C)共刺激角质形成细胞后,发现高糖可以很明显地抑制IL-17或poly(I:C)诱导的IL-33的表达,并且显著促进poly(I:C)诱导的前炎症因子IL-1p和IL-6的表达。我们进一步通过双荧光素酶报告实验筛选发现miR-9可以靶向IL-33 mRNA的3'UTR区抑制IL-33 mRNA的表达从而导致IL-33表达降低,并且在角质形成细胞中,使用miR-9的抑制剂抑制miR-9后,高糖抑制IL-17诱导IL-33的表达得到明显回复。此外,在角质形成细胞中,高糖能明显地诱导miR-9的表达。通过进一步研究我们发现高糖是通过NF-κB p65信号通路激活miR-9启动子而上调miR-9的表达。这些实验结果说明高糖通过激活NF-κB p65诱导miR-9的表达来抑制IL-33的表达。另一方面,我们也探讨了IL-33抑制炎症的功能机制。通过使用纯化的重组IL-33和poly(I:C)共刺激角质形成细胞,我们发现IL-33能很明显地使JNK2去磷酸化而抑制poly(I:C)诱导的前炎症因子TNF-α、IL-1β口IL-6的表达。进一步研究发现在角质形成细胞中IL-33可以明显地诱导负调节子SHP-1的表达,并且通过免疫共沉淀实验我们证明了SHP-1通过其磷酸酶位点与JNK2磷酸化位点结合使JNK2去磷酸化而失活。因此,我们认为IL-33是通过诱导SHP-1的表达使JNK2去磷酸化失活而抑制了TLR3依赖的炎症的发生。综上所述,本研究以糖尿病中IL-33低表达为切入点,首次从miRNA角度阐述了糖尿病患者皮肤伤口部位IL-33低表达机制,并且研究了高糖诱导miR-9表达机制及IL-33抑制炎症的功能机制。这些研究结果为解决糖尿病患者体内高糖环境是如何导致皮肤伤口过度炎症反应的产生而使伤口难愈合的问题提供新的研究思路与治疗靶点。
【关键词】：白介素33 miR-9 SHP-1 糖尿病 炎症
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 综述13-29
• 1 糖尿病皮肤伤口炎症反应13-17
• 1.1 糖尿病皮肤伤口愈合13-15
• 1.2 糖尿病伤口炎症反应15-17
• 2 白介素33(IL-33)在糖尿病炎症应答中的生物学功能17-21
• 2.1 IL-33及受体ST217-18
• 2.2 IL-33调节炎症应答的作用机理18-20
• 2.3 糖尿病中IL-33的表达调节20-21
• 3 microRNA在糖尿病炎症应答中的生物学功能21-26
• 3.1 microRNA的加工成熟过程21-22
• 3.2 microRNA的靶基因预测22-23
• 3.3 microRNA的表达调节23
• 3.4 microRNA对靶基因表达调控的机制23-24
• 3.5 microRNA在糖尿病炎症应答中的功能24-26
• 4 酪氨酸磷酸酶SHP-1在糖尿病炎症应答中的生物学功能26-29
• 4.1 酪氨酸磷酸酶SHP-126
• 4.2 SHP-1调节炎症应答的机制26-27
• 4.3 糖尿病中SHP-1的调节表达27-29
• 第二章 高糖诱导miR-9抑制IL-33表达的功能机制29-74
• 一 引言29-30
• 二 实验材料30-35
• 1 细胞、菌株及质粒30-31
• 2 实验试剂31-32
• 2.1 分子生物学实验试剂31
• 2.2 细胞培养试剂31-32
• 2.3 细菌培养试剂32
• 2.4 其他细胞实验试剂32
• 3 实验仪器与耗材32
• 4 引物32-35
• 4.1 实时荧光定量PCR引物序列32-33
• 4.2 克隆引物序列33-35
• 5 抗体35
• 三 实验方法35-46
• 1 细胞培养35-36
• 1.1 HEK、HaCaT和HEK-293T/17复苏35-36
• 1.2 HEK、HaCaT和HEK-293T/17传代36
• 1.3 HEK、HaCaT和HEK-293T/17冻存36
• 2 细菌培养36
• 2.1 LB培养基配制36
• 2.2 大肠杆菌DH5α培养36
• 3 总RNA提取、反转录和实时定量PCR36-38
• 3.1 总RNA提取36-37
• 3.2 RNA反转录37-38
• 3.3 实时定量PCR38
• 4 蛋白质提取、样品制备和免疫印迹(western blot)38-42
• 4.1 蛋白质提取和样品制备38-39
• 4.2 蛋白质免疫印迹39-42
• 5 蛋白免疫共沉淀(Co-IP)42
• 6 定点突变或缺失质粒构建42-43
• 7 细胞转染43-44
• 7.1 脂质体Lipofectamine2000转染43
• 7.2 脂质体PEI转染43-44
• 7.3 磷酸钙沉淀转染44
• 8 microRNA的检测与克隆44-45
• 8.1 microRNA的检测44-45
• 8.2 microRNA的克隆45
• 9 双荧光素酶报告实验45
• 10 实验数据统计分析45-46
• 四 实验结果与分析46-72
• 1 糖尿病小鼠皮肤伤口IL-33低表达46-47
• 2 糖尿病小鼠皮肤伤口炎症因子高表达47-48
• 3 高糖促进TLR3依赖的炎症因子的表达48-49
• 4 IL-33抑制TLR3依赖的炎症因子的表达49-51
• 5 高糖抑制poly(I：C)或IL-17诱导的IL-33的表达51-53
• 6 高糖通过激活NF-κB诱导miR-9抑制IL-33的表达53-64
• 6.1 高糖抑制IL-33 mRNA的表达53-54
• 6.2 高糖诱导miR-9的表达54-56
• 6.3 高糖诱导miR-9靶向IL-33 mRNA 3'UTR抑制IL-33的表达56-60
• 6.4 高糖不调节葡萄糖转运蛋白GLUT1/4和Dicer酶的表达60-61
• 6.5 高糖不诱导转录因子C/EBPα/β、VDR和GATA-1的表达61-62
• 6.6 高糖通过激活NF-κB诱导miR-9的表达62-64
• 7 IL-33诱导SHP-1表达抑制poly(I：C)诱导的JNK2的磷酸化64-72
• 7.1 IL-33抑制poly(I：C)诱导的JNK2的磷酸化64-65
• 7.2 IL-33诱导负调节子SHP-1的表达65-66
• 7.3 SHP-1与JNK相互结合66-67
• 7.4 JNK2与SHP-1磷酸酶活性位点结合67-69
• 7.5 SHP-1与JNK2磷酸化位点结合69-72
• 五 讨论72-74
• 第三章 总结74-76
• 参考文献76-86
• 附录86-87
• 硕士期间研究成果87

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本文编号：1116689