甲磺酸去铁胺对“Ⅰ型铁蓄积骨质疏松症”干预及部分机制的实验观察

发布时间：2017-11-07 17:15

  本文关键词：甲磺酸去铁胺对“Ⅰ型铁蓄积骨质疏松症”干预及部分机制的实验观察

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【摘要】：第一部分甲磺酸去铁胺对小鼠“Ⅰ型铁蓄积骨质疏松症”干预后骨量变化目的:本研究旨在探讨铁螯合剂甲磺酸去铁胺(DFO)对去势后枸橼酸铁铵(FAC)干预的雌性小鼠(模拟“I型铁蓄积骨质疏松症小鼠模型”)骨量的影响,为“I型铁蓄积骨质疏松症”探索新的治疗方案。方法:选取2月龄C57BL/6雌性小鼠24只,随机分为去势(OVX)组、去势+铁剂干预组(OVX+Fe组)、去势+铁剂+去铁胺组(OVX+Fe+DFO组)。三组均行双侧卵巢切除术,后两组在去势后一周采用0.12g/kg/w的枸橼酸铁铵干预6周,干预方法为腹腔注射,每周干预三次,OVX组采用同样方式和频次的生理盐水干预。随后OVX+Fe+DFO组采用4000mg/kg/w的DFO干预2周,干预方法为腹腔注射,一日两次,其他两组给予同样方式和频次的生理盐水干预。干预结束后处死小鼠,在处死小鼠的前10天及前3天给小鼠腹腔注射钙黄绿素。处死小鼠后分离双侧小鼠股骨,HE染色及微计算机断层扫描技术(Micro-CT)观察股骨远端微结构,钙黄绿素标记骨形成速率,普鲁士蓝染色观察股骨局部铁蓄积,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测骨组织骨保护素(OPG)、核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的表达,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测小鼠血清铁蛋白、OPG和RANKL水平。结果:血清铁蛋白水平方面,OVX+Fe组(408.90±17.20μg/ml)明显高于OVX组(87.53±3.73μg/ml)和OVX+Fe+DFO组(162.30±10.58μg/ml)(P0.05)。普鲁士蓝染色显示股骨铁蓄积OVX组OVX+Fe+DFO组OVX+Fe组。OVX+Fe组(0.09±0.02mg/mm3)比OVX组(0.13±0.01mg/mm3)的骨密度低(P0.05),OVX+Fe+DFO组(0.12±0.01mg/mm3)比OVX+Fe组(0.09±0.02 mg/mm3)的骨密度高(P0.05)。钙黄绿素标记显示:OVX+Fe组比OVX组两次标记线之间的间隔短,MAR小,差异有统计学意义(p0.05);OVX+Fe+DFO组比OVX+Fe组两次标记间的间隔长,MAR较大,差异有统计学意义(p0.05);OVX+Fe+DFO组比OVX组标记间的间隔短,MAR小,差异有统计学意义(p0.05)。OVX+Fe组(0.75±0.15)骨组织对OPG基因表达水平低于OVX组(1±0.2)和OVX+Fe+DFO组(0.89±0.15)(P0.05),OVX+Fe组(2.2±0.12)骨组织对RANKL基因表达水平高于OVX组(1±0.13)和OVX+Fe+DFO组(1.3±0.2)(P0.05),OVX+Fe组(2.8±0.4)骨组织对基因RANKL/OPG的表达比值高于OVX组(1±0.5)和OVX+Fe+DFO组(1.4±0.3)(P0.05)。OVX+Fe组(1.22±0.18 ug/L)血清OPG含量低于OVX组(2.33±0.33 ug/L)和OVX+Fe+DFO组(2.18±0.25 ug/L)(P0.05),OVX+Fe组(484.30±22.87 ng/L)血清RANKL含量高于OVX组(216.40±21.18 ng/L)和OVX+Fe+DFO组(289.70±20.76ng/L)(P0.05)。结论:DFO对“I型铁蓄积骨质疏松症”小鼠模型的骨量有恢复作用,DFO的干预作用与成骨和破骨功能都有关联。第二部分含铁环境中原代成骨细胞在甲磺酸去铁胺(DFO)干预后的生物活性变化及机制研究目的:研究甲磺酸去铁胺(DFO)对于含铁环境原代成骨细胞(FAC干预)活性的影响,并探究其可能的机制。方法:通过颅骨酶消化法从C57BL/6小鼠出生三天内胎鼠的颅盖骨分离原代成骨细胞(Osteoblast,OB),进行体外诱导分化培养、碱性磷酸酶染色鉴定后,传代培养至第三代。用CCK8法分别确定FAC及DFO的干预浓度后,分为3组:对照组,50u M/LFe(FAC)干预组,Fe+DFO组(50u M/LFe干预同时加入20u M/LDFO)。干预后三组细胞分别行碱性磷酸酶染色和活性定量,茜素红染色和结节计数,对相关基因(Runx2,Sp7,Bglap,Axin2,OPG,Sod1)进行定量PCR检测其m RNA的表达水平,DCFH荧光探针分析各组活性氧水平。将50u M/LFe(FAC)干预的原代成骨细胞,分为四组,分别用0,5,10,20 u M/LDFO干预后,行茜素红染色并计数,DCFH荧光探针分析各组活性氧水平,Westernblot检测Axin2蛋白表达水平。再将原代成骨细胞分为4组,分别为对照组,50u M/LFe干预组,Fe+DFO组(50u M/LFe干预同时加入20u M/LDFO),Fe+DFO+DKK-1组(50u M/LFe干预同时加入20u M/LDFO+500ng/ml DKK-1),用DCFH荧光探针分析各组活性氧水平,Westernblot检测Axin2及OPG蛋白表达水平,用茜素红染色检测其矿化能力。结果:CCK8结果显示,Fe50u M/L,DFO20u M/L干预,不影响细胞活性,各组之间没有统计学差异(P0.05)。与对照组相比,Fe剂干预组,成骨相关基因Runx2,Sp7,Bglap,Axin2,OPG表达下降,而氧化应激相关指标Sod1表达上升,而Fe+DFO干预组与Fe干预组相比成骨相关基因表达上升,氧化应激指标下降,差异有统计学意义(P0.05)。ALP染色及活性定量定量和茜素红染色及结节计数与对照组相比,Fe组下降,而Fe+DFO组比Fe组上升,差异有统计学意义(P0.05)。DCFH荧光显示活性氧水平,Fe组明显高于对照组,Fe+DFO组低于Fe组,差异有统计学意义(P0.05)。对50u M/LFe(FAC)干预的原代成骨细胞分别行0,5,10,20u M/LDFO干预。茜素红染色及结节计数显示随着DFO浓度增加,结节数量增加;Westernblot显示Axin2蛋白表达水平随着DFO浓度增加而增加;DCFH荧光显示随着DFO浓度上升,活性氧水平逐渐下降,差异有统计学差异(P0.05)。使用DKK-1干预后,DCFH荧光显示Fe+DFO+DKK-1组和Fe+DFO组活性氧水平无统计学差异(P0.05);Westernblot显示OPG及Axin2蛋白表达水平Fe+DFO+DKK-1组低于Fe+DFO组;茜素红染色及钙结节计数显示Fe+DFO+DKK-1组少于Fe+DFO组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:在含铁环境中,原代成骨细胞成骨生物学活性抑制、骨相关基因的表达降低,原因可能与ROS增加、Wnt通路改变相关;DFO干预可有效抑制ROS增加,恢复原代成骨细胞相关指标。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R580

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本文编号：1153356