GSK3β在TNAP缺乏导致的牙硬组织矿化异常中的作用

发布时间：2017-11-08 14:07

  本文关键词：GSK3β在TNAP缺乏导致的牙硬组织矿化异常中的作用

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【摘要】：低碱性磷酸酯酶症(Hypophosphatasia,HPP)是一种罕见的系统性遗传疾病。主要由于ALPL基因突变导致组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)活性降低从而引起骨和牙矿化代谢的异常。TNAP在骨与牙等硬组织的矿化过程中具有重要作用。最新研究表明,TNAP缺乏不仅仅会直接抑制矿化过程,还可能通过微环境影响相关间充质干细胞的生物学特性。间充质干细胞及其微环境是维持相关组织正常发育的重要基础,且在组织更新和修复过程中发挥着重要作用。在基因缺陷情况下干细胞表现出的细胞生物学行为将直接关系到患者的临床表现。本课题组前期研究发现,来源于HPP患儿的骨髓间充质干细胞(BMMSC)存在分化能力异常,同时Active-β-catenin表达降低,提示Wnt/β-catenin信号通路可能参与了低ALP活性条件下干细胞功能的改变。但与牙齿发育矿化密切相关的牙髓干细胞(DPSC)及牙周膜干细胞(PDLSC),其在ALPL基因异常情况下功能的改变尚未见报道。本实验拟研究DPSC和PDLSC在TNAP缺乏时的功能改变以及相关机制,在此基础上,初步探索利用恢复干细胞功能来治疗HPP相关异常的可能性。研究主要由以下几个方面逐步进行:第一,以ALPL基因敲除小鼠Akp2+/-为模型,观察敲除ALPL基因对牙齿硬组织的影响;第二,通过慢病毒转染的方法敲减正常人来源的hPDLSC与hDPSC中的ALPL基因,观察敲减ALPL基因对干细胞功能的影响,同时检测GSK3β及相关信号通路的变化;第三,观察GSK3β磷酸化抑制剂LiCl对ALPL基因敲减后hPDLSC与hDPSC功能的影响;第四,观察LiCl对Akp2+/-小鼠牙及牙槽骨异常的恢复作用,以此验证GSK3β及间充质干细胞在TNAP功能异常导致的牙硬组织矿化异常中的作用。第一部分ALPL基因敲除对小鼠牙硬组织的影响研究目的观察ALPL基因敲除对小鼠牙及牙槽骨的影响。研究方法(1)Micro-CT扫描野生型与Akp2+/-小鼠单侧下颌骨,观察Akp2+/-小鼠牙及牙槽骨的改变;选取第一磨牙冠部牙本质进行组织矿化密度定量分析。(2)扫描电镜观察野生型与Akp2+/-小鼠牙本质的矿化情况。研究结果(1)Micro-CT观察,比较于野生型,Akp2+/-小鼠的颌骨及牙槽骨存在明显缺损,牙齿牙髓腔扩大;(2)电镜扫描结果可见,与野生型比较,Akp2+/-小鼠牙本质矿化程度低,可见胶原纤维暴露。结论相比较于野生型小鼠,Akp2+/-小鼠存在不同程度的牙槽骨缺损以及牙本质矿化不全。第二部分ALPL基因敲减对hPDLSC与hDPSC干细胞功能的影响研究目的验证ALPL基因突变对hPDLSC和hDPSC干细胞功能的影响。研究方法(1)体外培养正常人来源hPDLSC与hDPSC,通过慢病毒转染的方法敲减hPDLSC和hDPSC中的ALPL基因;在此基础上用Western-Blot和茜素红染色法检测敲减后hPDLSC和hDPSC成骨能力的改变;(2)Western-Blot检测敲减后hPDLSC与hDPSC中的P-GSK3β表达。研究结果(1)Western-Blot结果可见,ALPL敲减后,hPDLSC与hDPSC中ALP蛋白表达量下降,其它成骨相关蛋白表达均下降;hDPSC中DSP表达下降。(2)敲减ALPL后,茜素红染色结果可见hPDLSC与hDPSC成骨能力下降。(3)敲减ALPL后,Western-Blot结果可见hPDLSC与hDPSC中P-GSK3β表达量下降。结论(1)通过慢病毒转染法可以有效地敲减hPDLSC与hDPSC中的ALPL基因,并且在敲减后,hPDLSC与hDPSC的成骨能力受到抑制;(2)在敲减ALPL后,hPDLSC与hDPSC中P-GSK3β表达下降,提示Wnt信号通路受到抑制。第三部分GSK3β抑制剂对ALPL敲减hPDLSC与hDPSC功能的影响研究目的观察LiCl对ALPL敲减hPDLSC与hDPSC成骨能力的影响,验证GSK3β在ALPL基因突变导致的干细胞功能异常中的作用。研究方法成骨诱导ALPL敲减后的hPDLSC和hDPSC,在诱导过程中加入GSK3β抑制剂LiCl;成骨诱导21d时,茜素红染色观察其成骨能力的改变。研究结果茜素红染色结果可见,在成骨诱导过程中加入LiCl后,hPDLSC与hDPSC成骨能力明显提高。结论在成骨诱导过程中通过抑制GSK3β而激活Wnt信号通路,可以使ALPL敲减hPDLSC和hDPSC的成骨能力提高,验证了ALPL基因突变是通过GSK3β影响干细胞的成骨能力。第四部分GSK3β抑制剂对于Akp2+/-小鼠牙硬组织异常的作用研究目的观察LiCl对Akp2+/-小鼠牙硬组织异常的作用研究方法对Akp2+/-小鼠注射LiCl(100mg/Kg),与Akp2+/-小鼠作比较,应用Micro-CT和扫描电镜观察注射后牙槽骨缺损以及牙本质矿化程度的变化。研究结果(1)Micro-CT结果可见,比较与对照组,注射组小鼠牙槽骨缺损得到明显改善;(2)扫描电镜观察,注射组小鼠牙本质矿化程度明显升高。结论通过注射GSK3β抑制剂LiCl,Akp2+/-小鼠牙及牙槽骨异常得到明显改善;证明ALPL基因突变可能会通过GSK3β等信号通路而影响牙来源间充质干细胞的功能,最终导致牙及牙周组织发育矿化异常。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R596;R781

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1 陈琦;GSK3β在TNAP缺乏导致的牙硬组织矿化异常中的作用[D];第四军医大学;2016年

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本文编号：1157433