含人干细胞白血病基因慢病毒载体转染Cajal样间质细胞的效果研究

发布时间：2017-11-10 15:29

  本文关键词：含人干细胞白血病基因慢病毒载体转染Cajal样间质细胞的效果研究

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【摘要】：目的观察携带增强绿色荧光蛋白(GFP)的含人干细胞白血病(SCL)基因慢病毒载体转染体外培养的豚鼠膀胱Cajal样间质细胞(ICC)的效果。方法 2014年10月—2015年8月,选取普通级成年健康豚鼠16只。构建含人SCL基因的慢病毒载体,并标定病毒滴度;采用随机数字表法选取健康豚鼠4只,采用颈椎脱臼方法将其杀死,体外培养豚鼠膀胱ICC。设置不同感染复数(MOI)(0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0),利用含人SCL基因的慢病毒载体转染ICC,在激光共聚焦显微镜下观察ICC生长状态并计算转染效率,确定最佳MOI。采用随机数字表法将ICC分为正常对照组、空白质粒对照组与慢病毒转染组,其中正常对照组加入1%磷酸盐缓冲液(PBS),空白质粒对照组加入空慢病毒,慢病毒转染组按最佳MOI加入含人SCL基因的慢病毒载体,计算各组转染效率,确定最佳转染时间。采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测SCL mRNA表达情况。上述实验均独立重复4次。结果经测定,病毒滴度为5×10~8TU/ml。倒置显微镜下发现一些特征性梭形细胞,其两侧有显著外凸分枝,细胞核较大,其外形规则,有序地实现细胞贴壁,而其他未贴壁细胞则呈现与ICC不一样的形态,胞体多为椭圆形,细胞两极无突起,整体形状扁平。激光共聚焦显微镜下可以发现酪氨酸蛋白激酶生长因子受体(c-kit)受体成功表达,证实培养的细胞是膀胱ICC。观察各组ICC生长状态,当MOI为0.5、1.0、5.0、10.0时,细胞生长状态较好,无细胞死亡,当MOI为50.0、100.0时,可见部分细胞死亡,细胞活性降低;MOI为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0时的转染效率高于MOI为0.5时(P0.05);MOI为5.0、10.0、50.0、100.0时的转染效率高于MOI为1.0时(P0.05);MOI为10.0、50.0、100.0时的转染效率高于MOI为5.0时(P0.05);MOI为50.0、100.0时的转染效率高于MOI为10.0时(P0.05);综合ICC生长状态及转染效率,确定含人SCL基因慢病毒载体转染ICC的最佳MOI为10.0。正常对照组、空白质粒对照组ICC中无GFP表达;慢病毒转染组转染3 d时ICC中GFP表达强度高于转染2 d、转染5 d时,确定含人SCL基因慢病毒载体转染ICC的最佳转染时间为3 d。慢病毒转染组中扩增产物大小与目的片段大小1 036 bp一致,而正常对照组及空白质粒对照组均未见特异性条带表达,表明SCL基因成功导入ICC。结论利用含人SCL基因慢病毒载体能高效转染体外培养的ICC,并成功介导SCL基因在ICC中的表达,为下一步研究利用SCL基因进行体内转染实验奠定基础。
【作者单位】： 石河子大学医学院附属第一医院泌尿外科;
【基金】：国家自然科学基金资助项目(81360120)
【分类号】：R587.2
【正文快照】： 糖尿病膀胱异常病症(DCP)是糖尿病末期出现频率最高的并发症之一,在糖尿病患者中的发病率为19%~84%[1-2]。DCP在发病末期会出现尿路感染、肾炎等,之后发展成尿毒症[3-4]。相关研究发现,神经生长因子(nerve growth factor,NGF)水平下降、氧化自由基形成、糖代谢异常、前列腺素E

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