PMPs对RA-FLS迁移和侵袭的影响及机制探讨

发布时间：2017-11-11 18:42

  本文关键词：PMPs对RA-FLS迁移和侵袭的影响及机制探讨

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【摘要】：目的：血小板微颗粒(PMPs)是血小板活化过程中形成的囊性小泡,含有细胞因子、白介素、趋化因子等多种生物活性物质。研究显示PMPs所具有的生物膜囊性结构,能够协助这些生物活性物质作用于靶细胞进而放大细胞间信号传递的级联反应,因而与包括类风湿关节炎(RA)在内的多种炎性、自身免疫性疾病有关。有报道认为PMPs够加强多种肿瘤细胞的迁移和侵袭能力,而RA成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)迁移和侵袭能力的增强是RA关节破坏的重要环节。因此我们认为PMPs有可能通过促进RA-FLS的迁移和侵袭,参与类风湿关节炎的发生与发展。本研究的目的是观察PMPs对人RA-FLS细胞株(MH7A)迁移和侵袭的影响,并初步探究PMPs调控RA-FLS迁移和侵袭的机制。方法：1、使用二磷酸腺苷(ADP)活化血小板,离心收集纯化PMPs,并使用流式细胞仪以PE标记的鼠抗人CD41抗体检测所提取PMPs的纯度。2、使用细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验研究PMPs对RA-FLS迁移的影响。3、使用Transwell细胞侵袭实验研究PMPs对RA-FLS侵袭的影响。4、使用RA-FLS与Ⅰ型胶原、人纤维连接蛋白和Matrigel进行细胞与ECM黏附实验研究PMPs对RA-FLS与ECM黏附的影响。5、使用基因芯片高通量分析研究PMPs作用后RA-FLS表达谱的变化。使用RT-qPCR从mRNA水平检测PMPs对基质金属蛋白酶1(MMP1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)表达产生的影响。6、使用Western blot方法研究MMP1蛋白水平表达的变化,并检测PMPs处理48小时后,RA-FLS中p-I-κB和p-NF-κB水平以及p-Erk和p-Akt水平的改变以探究PMPs激活NF-κB通路的可能途径。结果：1、PMPs纯度约为93.4%,可用于后续细胞水平的实验。2、细胞划痕实验中25 μg/ml PMPs组RA-FLS的愈合速度快于对照组,50μg/ml PMPs组又快于25 μg/ml PMPs组。Transwell田胞迁移实验显示对照组每100倍视野下平均穿过29.6±4.5个细胞,25 μg/ml PMPs组穿过62.4±7.2个细胞,50 μg/ml PMPs组穿过175.1±10.6个细胞,实验组与对照组存在统计学差异(p0.05)。3、Transwell细胞侵袭实验显示对照组每100倍视野下平均穿过19.9±3.7个细胞,25 μg/ml PMPs组穿过39.2±6.9个细胞,50 μg/ml PMPs组穿过80.4±9.4个细胞,实验组与对照组存在统计学差异(p0.05)。4. PMPs促进RA-FLS与三种ECM模拟物(Ⅰ型胶原、人纤维连接蛋白和Matrigel)发生黏附,25 μg/ml PMPs组细胞对Ⅰ型胶原、人纤维连接蛋白和Matrigel的黏附率分别为对照组的1.08±0.09倍、1.17±0.10倍和1.08±0.10倍,其中人纤维连接蛋白有统计学意义(p0.05)。50 μg/ml PMPs组细胞对Ⅰ型胶原、人纤维连接蛋白和Matrigel的黏附率分别为对照组的1.25±0.12倍、1.31±0.13倍和1.19±0.12倍,三种ECM模拟物均有统计学意义(p0.05)。5、高通量基因芯片检测显示PMPs能够影响RA-FLS多种基因的表达,富集分析结果显示差异性表达的基因主要集中于ECM受体相互作用、局部黏附、细胞黏附分子、MAPK信号通路相关的多种基因。基因芯片结果显示PMPs组中MMP1的表达量高于对照组。随后的RT-qPCR结果证实25μg/ml PMPs组中MMP1表达量高于对照组,而MMP2的表达不存在明显差异。6、Western blot结果显示25 μg/ml PMPs组相较于对照组,MMP1表达量,p-IκB水平,p-NF-κB水平和p-Erk水平均上调(P0.05)。50 μg/ml PMPs组中MMP1,p-IκB水平,p-NF-κB水平和p-Erk水平表达量的上调更为明显(P0.05)。而MMP2和p-Akt水平在各组间变化不明显。结论：PMPs可能通过Erk磷酸化而活化NF-κB通路,上调MMP1表达,促进人RA-FLS与ECM黏附,促进细胞的迁移和侵袭。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R593.2

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本文编号：1172655