重症肌无力患者肌细胞分拣微管连接蛋白17的表达及作用分析

发布时间：2017-11-12 17:03

  本文关键词：重症肌无力患者肌细胞分拣微管连接蛋白17的表达及作用分析

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【摘要】：研究背景重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是最常见的神经肌肉接头(NMJ)免疫疾病,世界范围内发病率约为200-300/百万,临床特点包括肌肉无力和易疲劳性,肌无力通常会在活动后加重,休息或睡眠后缓解。神经肌肉接头是由高度特化的运动神经元构成的突触前膜、突触间隙、以及由肌细胞膜构成的突触后膜组成,作用是参与神经肌肉之间的信号传导,将神经兴奋信号转化为肌肉收缩。运动神经元末梢释放乙酰胆碱(ACh)活化突触后膜的乙酰胆碱受体(AChR),导致肌细胞膜表面离子通道开放,使肌细胞去极化。AChR在反复折叠的突触后膜呈高密度簇集分布,这种簇集分布是信号传导的重要保证。哺乳动物在出生以后,神经肌肉接头的突触后膜形成褶皱样结构,AChR聚集在这些褶皱上,经过测算可知其在突触后膜上的10000-20000/um2,而在突触外的结构上密度仅为10/um2,这种现象涉及复杂的NMJ处的信号传递通路,目前关于AChR在NMJ的调节及聚集机制仍不明确。过去的几十年中,已经证实神经肌肉接头处有很多神经源性、肌源性以及促进不同分化的信号因子。这些因子包含跨膜蛋白、胞质内蛋白、以及胞外的一些重要蛋白,突触处的基本蛋白包含两种主要物质即集聚蛋白(Agrin)和神经调节蛋白,这两种物质由运动神经元产生,并且在NMJ的结构形成和维持方面有一定作用,其它的胞外蛋白如层联蛋白、IV/XIII胶原蛋白,蛋白多糖对NMJ形成也有一定作用。在肌细胞膜表面,肌肉特异性酪氨酸激酶(MuSK)是募集其它胞内、胞外物质的关键蛋白。膜表面低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4)与MuSK形成的复合体对于NMJ的功能至关重要。在肌细胞内部,很多蛋白如rapsyn蛋白、Dok7可以和MuSK结合传递信号诱导AChR在突触后膜的聚集。目前,研究者普遍认为Agrin-LRP4-MuSK复合体的信号传递通路在NMJ形过程起到重要作用,目前对这个复合体功能已有一定的认识,AChR的簇集需要运动神经元分泌的Agrin蛋白和突触后膜的LRP4蛋白结合,Agrin-LRP4复合体激活突触后膜MuSK蛋白,诱导AChR在突触后膜聚集。低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4)与低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)均属于LDLR家族成员,研究已经表明LRP1在细胞内的代谢与细胞分拣微管连接蛋白17(SNX17)有关,SNX17属于细胞分拣微管连接蛋白(sorting nexin,SNX)家族成员,SNX家族包括存在于胞内和胞膜的多种蛋白质,其作用是参与跨膜蛋白的内吞及在胞质内的分拣,SNX17蛋白诱导LRP1在细胞内的循环利用,抑制LRP1被溶酶体降解,LRP1与LRP4具有相同的结构域即NPxY结构域,因此LRP4存在与SNX17结合的可能。SNX17分布于所有组织,我们研究团队前期研究发现MG患者胸腺中SNX17mRNA含量明显增高,但SNX17在肌肉的表达情况及对NMJ处LRP4代谢影响情况未知。本研究在比较MG患者SNX17分子含量基础上,用免疫荧光观察SNX17与AChR形态,了解MG患者肌细胞SNX17分子表达情况,分析与AChR分子的关系。目的本研究采用免疫荧光法观察肌丝AChR、SNX17分子形态及分布;荧光定量PCR、蛋白免疫印迹法比较两组肌细胞SNX17含量。方法1.免疫荧光法观察大鼠AChR及人AChR、SNX17分子形态:取大鼠、MG组和对照组肋间肌标本,4%多聚甲醛固定10 min,在载玻片上的剥离单根肌丝,0.5%Triton X-100通透20 min,5%BSA封闭1 h,稀释比例1:50的鼠抗人SNX17抗体孵育4℃过夜。37℃复温30 min,稀释比例1:100的AF-g350标记羊抗鼠抗体及1:220的α-银环蛇毒素标记的四甲基罗丹明(α-BTX),37℃孵育1 h,显微镜观察不同激发光下的AChR、SNX17形态及分布。2.荧光定量PCR法检测肌细胞SNX17 mRNA含量:在Gene Bank中获得人SNX17序列,Premier5.0设计引物,上游引物序列5,-CAATGGGT CTTGCCGAACAG-3,,下游引物序列5,CGCCTACGTGGCCTATAACAT-3,。β-actin作为内参,其上游引物序列为5,-GGGCCGGACTCGTCATACT-3,,下游引物序列为5,-CCTGGCACCCAGCACAAT-3,。取上述肋间肌各20mg,用Trizol一步法提取RNA,按反转录试剂盒说明书将RNA反转成cDNA,荧光定量PCR法采用20ul反应体系,荧光变性反应条件为95℃30S;PCR反应条件:95℃5 S、55℃2 min、72℃30 S,40个循环;取10ul PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,以确保引物设计的特异性。将内参基因Ct值与目的基因的Ct值之比作为标准化的目的基因相对定量,即β-actin的拷贝数/目的基因拷贝数。3.蛋白免疫印迹法检测肌细胞SNX17蛋白含量:取上述肋间肌各20mg,液氮中快速研磨得到匀浆,加入裂解液,室温避光30 min,5000 r/min离心5 min后取上清,BCA法测细胞蛋白浓度,每孔加20μl样品,β-actin作为内参,稀释比例1:1000鼠抗人SNX17抗体及1:2000兔抗人β-actin抗体孵育4℃过夜,37℃复温30 min,稀释比例1:4000 HRP标记的羊抗鼠抗体和1:4000 HRP标记的羊抗兔抗体37℃孵育1 h,曝光成胶片,采用图像分析软件Quantity One分别测定目的基因和β-actin的显色条带平均值,各组蛋白表达强度为二者平均值比值。结果1.患者一般临床资料:对MG组(10例)与对照组(14例)的年龄、性别进行比较,两组患者的年龄、性别差异无统计学意义(表1)。2.AChR、SNX17形态学观察:AChR一般位于肌纤维纵轴的中部,呈红色椭圆形突起状,轮廓线光滑连续完整。对照组AChR呈曲奇饼干样,内部有精细分支的网络状结构;而MG组仅可观察到呈不连续完整的红色外周轮廓线,内部网状结构破碎,呈空泡样;但可观察到SNX17呈同样形状蓝色椭圆形突起,两者位置、形态一致,经Merge后,图像完全重叠(图1、图2)。3.肌细胞中SNX17基因和蛋白定量结果:荧光定量PCR法结果显示,MG组SNX17 mRNA含量明显增高,差异有统计学意义(t=5.75,P0.05),蛋白免疫印迹法结果显示,SNX17蛋白含量明显增高,差异有统计学意义(t=3.03,P0.05)(图3,表1)。结论(1)MG患者肋间肌肌细胞SNX17表达增高,存在促进LRP4在细胞内再循环的可能性。(2)SNX17与AChR在神经肌肉接头处共定位,促进AChR聚集,是维护神经肌肉接头信号通路完整的重要分子。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R746.1

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